目前临床上能影响血中LDL水平 类，一类是与遗传有关的原发性因素， 蛋白血症；另一类是因其它疾病引起& 继发因素而致的LDL升高应以治疗H 原发因素所致的LDL升高则通过降,

l引言

尚脂血症尤其是低密度脂蛋白（Low density lipoprotein, LDL)导致动脉粥样硬化是公认的事实 ，由此而引起的心、脑血管疾病严重危害人类的健 

进行控制，但效果并不满意。70年代以来，去除LDL 的血液净化疗法逐渐应用于临床，其中的吸附剂吸 附法由于对LDL具有选择性吸附，所以取得了较好 的疗效。制备LDL吸附剂首先涉及的一个重要环节 就是吸附剂载体的选择和合成。它的性质能影响吸 附剂在吸附选择性以外的其它性能。一般来说，应用 于血浆的特异吸附剂载体必须具备如下性质：（1)灭 菌后其结构及化学性质不变或变化很小;（2)高黏稠 流体血浆的快速流动不引起聚集;（3)载体本身对血 浆成分的非特异性吸附很少;（4)由于机械作用原因 吸附剂载体破碎后不脱落出微粒;（5)要有足够的吸 附面积;（6)必需有优良的血液相容性。根据前述要 求，本文采用反相悬浮聚合法合成具有一定粒径和 孔径的聚丙烯酰胺微球作为载体，以丝氨酰-天冬氨 酰#氨酸（SDE)负电性三肽（此三肽广泛存在于 LDL受体配体结合域7个重复序列的羧基末端，对 LDL受体特异性识别LDL起着重要作用[1'2])作为 配体固定于其上制成LDL亲和吸附剂，并初步研宄 了此吸附剂吸附LDL的性能。

2材料和方法

2.1实验试剂与仪器

丙烯酰胺(AAM)，AR,天津市化学试剂研宄 所;亚甲基双丙烯酰胺(MBA), BR,中国科龙

精细化工厂；过硫酸钾（KPS), AR，西安化学试剂 厂；四甲基乙二胺(TEMED),生化试剂，中国上海 前进化学试剂厂；司本~80( Span~80)，上海市申隆制 药厂；吐温~80(Tween~80)，上海市申隆制药厂；甲 苯（Methylbenzene), AR,中国成都金山化工试剂 厂；氣苯(Chlorobenzene)，AR,中国上海试剂一■厂； 戊二醛，AR,天津市华真特种化学试剂厂；1-乙基- 3~( 3-二甲基氨丙基)泰二亚胺(EDC), BR, ACR0S Oganics公司；SDE三肽，本实验室合成。悬浮聚合 反应釜，本实验室自备；图像分析仪，中国科学院;X 射线衍射仪,PW1700, KRATKY狭缝系统，菲利浦 公司；日立牌X~650型扫描电镜;THZ~82恒温振荡 器，常州国华电器有限公司；自动生化检测仪，日本 岛津。

2. 2微球的制备及其粒径和单分散指数的测定

将溶有司本~80和吐温~80的甲苯和氯苯混合 物(；油相)加入悬浮聚合反应II中，保持60 °C的反应 温度，缓慢搅拌使加热均匀，并通入氮气5 min。将 引发剂溶液加进溶有AAM和MBA的水相中，并 加催化剂预引发反应2 min,然后将其立即加入至 60°C的反应釜中，调整搅拌转速为200〜300 rpm， 继续用氮气保护聚合反应。2 h后停止反应，产物用 蒸馏水反复冲洗并置于蒸馏水中备用。聚合体系的 配方见表1。 

表1聚合体系的配方

Table 1 The composition of reversed-phase suspension polymerization system

Water phaseOil phaseDispersion[systemInitiate agent

AAMMBAH2OM ethylbenzene ChlorobenzeneSpan 80Tween 80KPSTEMED

(g)(g)(g)(ml)(ml)(g)(g)(G)(drop)

9. 1611.06675112. f) 112.51. 350.450. 04093

(18.4 ： 1)

Numerical ratio in the bracket is the mole ratio of AMM and MBA

 

将微球点样至电镜样品台上，自然干燥,表面喷 金，用扫描电镜作形貌分析。将微球样品在载玻片上 制样，送至图像分析室，选取500粒以上的样品微球 作统计分析，返回统计样本的粒径数据集合，得到样 本的平均粒径(7))和单分散指数(MDI)。MDI按下 式求得[3]:

U^ kLDi /( ZDl • LL»|

i= 1i= 1i= 1

式中：k为样品中粒子总数;D,代表被测微球的粒 径。最后用粒径分布直方图进一步表示样本的粒径 特征。

2.3不同交联度微球的制备及其孔径的测定

以2. 2节方法按表2的配方进行不同交联度微 球的制备。

用X光小角散射法测定各合成样品的孔径。 2.4 LDL吸附剂的制备及其吸附性能的测定

参阅文献[4]。

3结果

按表1配方合成的微球，其形貌率 图la可知合成样品微球之间分得很于 匀，很少有粘连的情况。图lb显示样 的球形。微球的平均粒径为111.S 1. 12,粒径分布直方图见图2。常将IV 

表2不同交联度聚合体系的配方

Table 2 The composition of reversed^phase suspension polymerization system with various degrees of crosslinking

Water phaseOil phaseDispersion systemInitiate agent

Experiment

No.AAM

(g)MBA

(g)H2〇

(g)Methyl benzene (ml)Chioro benzene (ml)Span 80 (g)Tween 80 (g)KPS

(g)TEMED (drop)

A8. 3761. 851 (9. 8： 1)75112. 5112. 51. 350.450. 04093

B9. 1611.066 (18.4 ： 1)75112. 5112.51.350.450. 04093

C9.5030. 724 (26. 8 : 1)75112. 5112. 51.350.450. 04093

D9.7860.441 (46. 0 : 1)75112. 5112.51.350.450. 04093

* Numerical ratioin the bracket isthe mole ratio of AAMand MBA

图1聚丙烯酰胺微球电镜形貌图(a放大200倍,b放大1000倍）

Fig 1 The SEM morphology of polyacrylamide beads( la X 200, lbX 1000) 

为粒子单分散的标志|3]，由此可知本实验一次成球 未达到粒子单分散的要求；同时样品的粒径分布直 方图也证实了这点,其柱形分布图宽而低。为此，尝 试使用了筛分的方法。在水流的作用下对样品用标 准分样筛进行筛分，结果表明大部分微珠在80〜 120目与120〜180目之间，对筛分所得的两组样品 用图像分析仪统计粒径，结果见图3。筛分后两个级 分的粒径和单分散指数见表3。从图3和表3可知, 筛分后两个级分均达到粒子单分散的要求，按要求 (具体见讨论)我们选择平均粒径为142. 1 pm的级 分作为吸附剂载体。

表3样品的筛分结果

Table 3 The sieving result of sample polyacrviamiH^

Fraction

l(80-120mesh)87. 1

2( 120-180mesh)142. 1

用X光小角散射法测得的不同交联I 如表4。

表4 X光小角散射法测得的不同交联度微球的孔径 Table 4 The pore diameter of polyacrylamide bead with various

degrees of crosslinking determined by small angle X^ay scattering

SampleA(1 ： 10)B(1 ： 18)C( 1 ： 27)D( 1 ： 46)

R( nm)67. 5119. 8129.5144. 3

为了观察不同交联度对聚丙烯酰胺微球表面孔 径的影响，本实验根据表4做图并拟合得到了交联 度与聚丙烯酰胺微球表面孔径的关系(见图4)。

在图4中用A至D四点拟合可得一直线，由以 下方程表示：

167. 87- 987. 5SX(X< 0. 1)(1) 

 

图3样品筛分后的粒径分布图

Fig 3 Histograms of polyacrylamide bead distribution of sieved polyacrylamide bead

Fraction 1: 80-120mesh； Fraction 2: 120-180mesh 

以本实验合成的具有一定粒径和孔径的聚丙烯 酰胺微球为载体，以丝氨酰-天冬氨酰I氨酸 (SDE)负电性三肽为配体固定于其上制成LDL亲 和吸附剂，其对LDL和高密度脂蛋白（HDL)的吸 附性能如图5所示。

Adsorbent

图5两种吸附剂对LDL和HDL的吸附率^±s, n= 4)

A代表聚丙烯酰胺微球;B代表用戊二酸法制备的吸附剂；C代表用 EDC法制备的吸附剂

Fig 5 The adsorption rate of two adsorbents for LDL and HDL

(x±s，4)

A: polyacrylamide bead; B adsorbent: ligands a BGP100 by glutaraldehyde； C adsorbent： ligands BGP100 by EDC

4讨论

如前所述，吸附剂载体的性质能丨 吸附选择性以外的其它性能，因此应：

行选定。本研宄选择聚丙烯酰胺微球作为载体是基 于其以下特点：不含生物多聚体，因而不易滋生微生 物；具有相对较好的pH稳定性(PH2-10)和化学稳 定性;具有的酰氨基在温和反应条件下易于接上各 种类型的臂和/或配体[5];利用交联度和/或共聚方 法，聚丙烯酰胺微球的孔径、弹性和填柱的透过率可 按需要进行调节；由于丙烯酰胺共聚物微球的弹性 和疏水性可调，因而吸附LDL的强度远远大于吸附 其他的血浆蛋白[6];具有较好的亲水性、优良的生物 相容性和很小的非特异性吸附[7];在121 °C蒸汽或 2. 5 Mrad下消毒不失去其原有功能[7];大孔径聚丙 烯酰胺微球有足够的吸附面积用于去除血中的 LDL。

本实验合成聚丙烯酰胺微球的最终粒径为 142. 1 A/m,孔径为119. 8 nm，这样的结构使其无论 应用于血浆还是全血均有较好的血液相容性，且有 足够的LDL吸附面积。因为微球孔径在100〜200 nm范围内时,LDL可扩散通过微孔进入微球内部， 致LDL的吸附面积大大增加；而粒径比LDL大的 成分如血细胞等却被排除在微球之外，使血细胞等 成分与吸附材料的相互作用减少，材料获得较好的 血液相容性[8'9]。

由图4和拟合公式（1)可知，在MBA与A AM 总量一定和MBA与AAM摩尔比小于0. 1的条件 下，随着MBA与A AM摩尔比的减小，微球的孔径 逐渐增大，也即MBA的用量越小，微球孔径越大。 这是由于交联剂用量增大时，微球内交联点距变窄， 网络空间变小，交联密度增加，因而微球孔径变小。 公式（为以后用类似方法合成聚丙烯酰胺微球，更 好地调控其孔径以适应作为LDL吸附剂载体的需 要提供了有益的理论依据。

通过对合成的聚丙烯酰胺微球氨乙基化、肼解、 碱水解等相应的处理后，再以戊二醛或1-乙基-3- (3-二甲基氨丙基)泰二亚胺为偶联剂，辅以氰基硼 氢钠催化（以戊二醛为偶联剂时用），就可在很温和 的条件下接上适当的伺隔臂”和配体(SDE)。这不 仅对制备LDL吸附剂十分有利，而且对在其上固定 其他配体从而制备相应的吸附剂同样很有效。

从图5我们可以看出，无论被测血浆中是否存 在高浓度的Ca2+，未偶联配体的聚丙烯酰胺微球对 LDL及HDL的吸附很少，而当固定上SDE酉己体制 成吸附剂后（无论是B吸附剂还是C吸附剂）其对

LDL的吸附率明显增高，与聚丙烯酰胺微球相比，P <0.05。此现象一方面说明本实验合成的聚丙烯酰 胺微球非特异性吸附很小，另一方面也说明本聚丙 烯酰胺微球作为LDL特异性吸附剂的载体是有效 的。

本实验采用反相悬浮聚合法合成了具有一定粒 径和孔径的聚丙烯酰胺微球，并对相应工艺进行了 探讨；同时在微球上固定SDE配体制成LDL吸附 剂，对此吸附剂吸附LDL性能进行了初步研究。本 微球虽然基本上符合作为LDL吸附剂载体的需要， 但仍有一定的缺点，如其强度不够，在体外制成吸附 柱进行实验时有可能引起聚集，这些需在以后实验 中加以改进。