聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤:
聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤作为检测DNA序列差异的有效手段，变性凝胶电泳在我室广泛使用，但是也有其使用范围。在我室还有一种常用的非变性凝胶电泳技术，简称SSCP（Single Strand Conformation Polymorphism，单链构象多态性）。
聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤原理：在SSCP测定中，双链DNA（dsDNA）被变性成为单链DNA（ssDNA），每一条单链DNA都基于它们的内部序列而呈现出一种独有的折叠构象，即使同样长度的DNA单链因其碱基顺序不同、甚至单个碱基的不同会形成不同的构象。这些单链DNA在非变性条件下，用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，单链DNA的迁移率和带型，都取决于其折叠构象和电泳时的温度。
SSCP与变性凝胶电泳基本一致，聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤不同之处有以下几点：
a． SSCP使用非变性凝胶进行电泳，即在凝胶配制中不加入变性剂。我室常用8%非变性胶（丙烯酰胺 80g，N- N，-亚甲双丙烯酰胺 2.76 g，10×TBE 50ml，加水定容到1L）
b． 工作环境，由于SSCP受温度影响，所以在电泳过程中应防止温度的升高，所以电泳环境为电压400V，电流50mA，单板电泳功率为9W，不用预热。缓冲液最好用新配制的。
c． 由于电泳功率较低，所以电泳时间较长，通常需要10小时以上，因此一般电泳需要过夜。室温在25。C以下。
1. 聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤
聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量的蛋白质，小于1kb的DNA片段和DNA序列。分析装载的样品容量大，可回收，DNA纯度高。在催化剂TEMED（N-N-N，- N，-四甲基乙二胺）和过硫酸胺的作用下，丙烯酰胺聚合成长链，聚丙烯酰胺链在交联剂，N- N，-亚甲双丙烯酰胺的参与下，聚丙烯酰胺链与链之间交叉联结形成凝胶。
1.1 配制30%丙烯酰胺：丙烯酰胺29g
N- N，-亚甲双丙烯酰胺 1g
加水至100ML，40C棕色瓶可保存二月
1.2 配制5×TBE缓冲液：
TRIS碱 54克
硼酸 27.5克
EDTA 3.72克
加水至1L
1.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤所用试剂体积
试剂
制备不同浓度聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤（%）凝胶所用试剂体积（ml）
3.5
5.0
8.0
12.0
20.0
30%丙烯酰胺
11.6
16.6
26.6
40.0
66.6
水
67.7
62.7
52.7
39.3
12.7
5×TBE
20.0
20.0
20.0
20.0
20.0
10%过硫酸铵
0.7
0.7
0.7
0.7
0.7
1.4 DNA在聚丙烯酰胺凝胶中有效分离范围
丙烯酰胺（%）
有效分离范围（bp）
二甲苯氰FF
溴酚蓝
3.5
1000-2000
460
100
5.0
80-500
260
65
8.0
60-400
160
45
12.0
40-200
70
20
15.0
25-150
60
15
20.0
6-100
45
12
2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤具体步骤
2.1从NaOH池中捞出浸泡的玻璃板，取出上面的残胶
2.2 把玻璃板拿到流动水处洗刷干净
2.3 洗干净的玻璃板至于玻璃板架上晾干
2.4 用乙醇擦洗玻璃板
2.5 带凹口的背板涂上硅化剂，面板则涂上粘合剂，防止电泳完毕发生撕胶和脱胶的可能（涂摸要均匀）
2.6 面板在下，背板在上。两侧用塑料板密封，并用夹子夹好。底部调节使之水平
2.7 将加入催化剂后的凝胶沿凹口均匀倒下，插入适当的封条。勿使封条下留下气泡。用夹子夹紧封条部位
2.8 室温聚合30分钟，小心取出凹口处封条，用水冲洗加样孔（否则封条所残留的丙烯酰胺在加样孔聚合产生不规则表面，引起DNA带变形）
2.9 将凝胶固定在电泳槽里。带凹口背板朝里，面向缓冲液槽
2.10 用0. 5×TBE灌满电泳槽的缓冲液槽，接上电极，打开电源。调试工作环境为电压2000-2200V，电流150-200mA，单板电泳功率为80W。预热30分钟左右。
2.11 点样之前需切断电源，用枪将点样孔的气泡及胶吹出，然后插入点样梳，注意不要插得太深，否则点样胶面会变形，影响美观及点样。
2.12枪吸加样品，PCR产物先加loading buffer 10ul ,再变性5分钟左右，接着在冰水中冷却5分钟以上方可点样，点样完毕，电泳开始。
2.13 电泳至所需位置后，切断电源，拔出导线，回收缓冲液，卸下玻璃板。在工作台上，将背板撬起，放回原处。将面板进行银染
3. 电泳后的银染检测
3.1 原理：
影像产生是由于核酸在胶上所占部位与周围的氧化——还原势不同而产生。银染液中的银离子（Ag+）可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒，这样核酸电泳带就染成了黑褐色。
3.2 银染
银染液的配制：称2.5至3.0g AgNO3加1200---1400ml水
银染:将电泳完的面板首先在银染漂洗盆了漂洗赶紧，使胶面上没有异物。玻璃板反面没有污染物。
将加入银染液的银染盆放在摇床上后，将面板放入银染1小时左右。
3.3 显影
显影液的配制：NaOH---20g, Na2CO3----0.6g,甲醛4.5ml，加水1200ml
显影：将面板从银染盆里取出，在银染漂洗盆里漂洗，震荡5-6次，取出后使其表面尽量无水，再放入已加入显影液的显影盆里（显影，显影液的配制及甲醛的加入都需要在通风橱的摇床上进行）显影过程大约10到15分钟，以DNA条带清晰可见为准。
将显现完毕的板子在显影漂洗盆里漂洗后，方可读带。
本实验室凝胶电泳相关常用试剂配方：
1. 我实验室常用的聚丙烯酰胺凝胶是6%变性聚丙烯酰胺凝胶（简称变性胶，PAGE），就是在普通聚丙烯酰胺凝胶中加入变性剂。我们使用的变性剂是尿素。
6%PAGE具体配制方法为:
尿素210g，10×TBE 25ml ，丙烯酰胺28.5 g ，亚甲双丙烯酰胺 1.5g，加水定容至500ml，过滤后使用。
考虑到方便使用的问题，一般一次配制2L（尿素840g，10×TBE100ml，丙烯酰胺114g，亚甲双丙烯酰胺6g）。
2. 10×TBE（Tris-硼酸-EDTA）的配制
EDTA 7.44g，硼酸55g，Tris 108g，加水定容至1000ml
3. 10%过硫酸氨（AP）
10g过硫酸氨，纯水定容至100ml
4. 硅化剂配方
二甲基二氯硅烷：无水乙醇=13ml：500ml
5. 反硅化剂（粘合剂）配制
无水乙醇 500ml（一瓶），44ddH2O，3.3冰醋酸，550ul Bind silnce（3，-Trimethoxysilyl propyl）
配置完遮光4。C保存
6 loading buffer 配制
0.1g 二甲苯氰，0.1g 溴酚蓝，1ml 0.5molEDTA ，100mL甲酰胺
实验试剂：
试剂贮备液：
1、 1mol/L HCl48ml，Tris36.6g，TEMED0.23ml，加蒸馏水配成100ml，pH8.9。
2、 1mol/L HCl48ml，Tris5.98g，TEMED0.46ml，加蒸馏水配成100ml，pH6.7。
3、 Acr28g，Bis0.735g，加蒸馏水配成100ml。
4、 Acr10g，Bis2.5g，加蒸馏水配成100ml。
5、 核黄素4mg，溶于100ml蒸馏水中。
6、 蔗糖40g，加蒸馏水配成100ml。
7、 电极缓冲液：Tris6.06g，甘氨酸28.52g，加蒸馏水配成1000ml，pH8.3，用时稀释10倍。
8、 过硫酸铵0.14g，加蒸馏水配成100ml。
9、 溴酚蓝1mg溶于100ml蒸馏水中。
10、 脱色溶液：甲醇5ml，冰醋酸9ml，加蒸馏水配成100ml。
11、 蛋白质染色液：考玛斯蓝G─250 200mg，甲醇100ml，冰醋酸20ml，蒸馏水80ml，溶解后混合之。
12、 过氧化物酶染色液：
1) 染色液甲：联苯胺─抗坏血酸染色液，染色数分钟。抗坏血酸70.4mg，联苯胺溶液20ml（2g联苯胺溶于18ml用文火加热的冰醋酸中，再加蒸馏水72ml），0.6%过氧化氢20ml，蒸馏水60ml。
2) 染色液乙：联茴香胺染色液，染色至少1小时。0.1mol/L醋酸缓冲液，pH5.5（0.82g醋酸钠溶于80ml蒸馏水中，用醋酸调节至pH5.5，定容至100ml）。30%H2O20.25ml溶于50ml蒸馏水中，用时新鲜配制。邻联茴香胺（o─dianisidine）100mg，溶于100ml醋酸缓冲液(1)中。用时取溶液（2）5ml，溶液（3）50ml，混合之。
实验步骤：
凝胶的制备：
1、 清洗干净两块玻璃板，晾干后按要求装配好垂直电泳板，两块玻璃板的两侧及底部用1%的琼脂糖封边，防止封闭不严而使聚丙烯酰胺液漏出。
2、 将装好的玻璃电泳板倾斜成45～60℃角。把玻璃板在灌胶支架上固定好。
3、 分离胶：按1∶3∶8∶水=1∶2∶4∶1的比例，先将贮备液1，3和水放在一小烧杯中，过硫酸铵贮备液放在另一小烧杯中，一起放在真空干燥器中，用真空泵抽气15分钟，取出将过硫酸铵溶液并入，用玻棒轻轻搅动使之混合，立即注于干洁的玻璃板中。玻璃板垂直放置，用滴管吸取混合液，沿管壁注入，注意不要进入气泡。胶液注到离玻璃板口2cm处，立即在其表面覆盖少量蒸馏水，静置1小时左右，当见到水层下面有一清晰的界面时，则表明胶已聚合凝固，用吸水纸小心吸去上面水层。
4、 浓缩胶：按2∶4∶5∶6=1∶2∶1∶4的比例，同上法制备浓缩胶，连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插入样梳,静置40分钟。
电泳步骤：
1、 拔出样梳后,在上槽内加入缓冲液,没过锯齿时可拆去底端的琼脂糖。
2、 用微量注射器距槽底三分之一处进样,加样前,样品在沸水中加热3分钟，去掉亚稳态聚合。
3、 电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在10mA，当进入分离胶后改为20mA，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。
4、 凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色1小时左右。
5、 脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到区带清晰。
6、 实验结果分析。
注意事项：
1、 固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板。
2、 凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶.注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡。
3、 水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡。
4、 凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。
5、 样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平。
6、 要使锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果。
7、 注射器不可过低,以防刺破胶体,也不可过高,在样下沉时会发生扩散。
8、 为避免边缘效应,最好选用中部的孔注样.
9、 剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分。
变性:是指蛋白质被SDS变性。变性后，不同蛋白质的荷质比相同，在电泳的涌动速度只跟分子量成正相关。
pAGE：既然浓度已经决定了 那么凝胶形成的孔径也就固定不变了。电泳中大分子跑的慢，小分子跑得快 因此蛋白质得以分离。
聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacryamide gel electropHoresis, PAGE)是由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化作用下形成的三维网状结构物质。在不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳中，凝胶的制作是分层进行的，因此凝胶不仅有分子筛效应，还具有浓缩效应。和琼脂糖凝胶相比，聚丙烯酰胺凝胶难于制备和处理。它们的分离范围较窄。但是它们也有突出的优点，由于是不连续的pH 梯度，故样品被压缩成一条狭窄的区带，因而增强了分离效果，提高电泳分辨率。尤其对小DNA 片段的分析(5～500bp)。在这一范围内，仅差1bp 的DNA 分子也能清晰地分开。其次，DNA 纯度很高。从聚丙烯酰胺凝胶中得到的DNA 纯度很高以致于下步操作不用任何处理。还有，它的负载容量高。该胶的标准加样槽中可以加入高达10mL 的DNA 样品，而不影响电泳分辨率。多应用于分离纯化和鉴定大小为5～500bp 的DNA 片段。聚丙烯酰胺凝胶电泳有连续与不连续体系两种，前者指在整个电泳体系中的缓冲液pH 值和凝胶孔径大小相同，主要用于核酸分析。后者主要用于蛋白质样品的分离，它除了电泳槽中的缓冲体系和pH 值与凝胶中不同外，凝胶本身也由缓冲体系、pH 值和凝胶孔径不同的两种凝胶堆积而成。
聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳是以聚丙烯酰胺凝胶做支持物的一种区带电泳，由于此种凝胶具有分子筛的性质，所以本法对样品的分离作用，不仅决定于样品中各组分所带净电荷的多少，也与分子的大小有关。其次，聚丙烯酰胺凝胶电泳还有一种独特的浓缩效应，即在电泳开始阶段，由于不连续pH 梯度的作用，将样品压缩成一条狭窄区带，从而提高了分离效果。
聚丙烯酰胺凝胶具有网状立体结构，很少带有离子的侧基，惰性好，电泳时，电渗作用小，几乎无吸附作用，对热稳定，呈透明状，易于观察结果。
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂亚甲基双丙烯酰胺(简称Bis)在催化剂的作用下，聚合交联而成的含有酰胺基侧链的脂肪族大分子化合物。
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