聚丙烯酰胺降解菌的筛选及降解含聚丙烯酰胺污水的室内研究:
聚丙烯酰胺降解菌的筛选及降解含聚丙烯酰胺污水的室内研究,近年来，我国东部的大多数油田基本上已经进入高含水开发后期，传统的水 驱已不能满足采油的需要，聚合物驱油技术在老油田中得到广泛的推广。部分水 解聚丙烯酰胺在为油田提高采收率的同时，对当地环境也产生了相当大的危害。 首先，含聚污水处理遇到很大问题，油水分离难度加大，采出水含油量严重超标; 含聚污水处理成本、难度加大，且部分含有较高浓度的聚丙烯酰胺采出水外排。 其次，由于地层结构原因，聚丙烯酰胺在进入地下油层的同时很难避免渗透到地 下水层。残留在环境中的聚丙烯酰胺会发生缓慢降解，释放出有毒的丙烯酰胺单 体。聚丙烯酰胺在地面水体和地下水中的长期滞留，必将对当地水环境造成潜在 的危害。目前，聚丙烯酰胺的应用范围和规模正呈现快速增长趋势，同时其在环 境中的累积、迁移、转化带来的毒性亦将逐渐显露出来，并将给生态环境带来不 可估量的危害。因此，含聚污水的处理成为亟待解决的问题。由于微生物特殊的 环境适应性、高繁殖速率和变异性，利用高效降解聚丙烯酰胺的菌株处理含聚污 水将成为解决由聚丙烯酰胺引起的环境问题的有效手段。
本论文以聚丙烯酰胺为研究对象，对生化法处理含聚聚丙烯酰胺污水进行了 探讨。在对聚丙烯酰胺的影响因素考察的基础上优化了生物降解体系中聚丙烯酰 胺的评价方法，筛选出对聚丙烯酰胺有一定降解能力的菌种，并对降解条件进行 了优化优化，初步探讨了聚丙烯酰胺好氧降解机理，并将降解菌应用于生化处理 模拟实验。得出了以下结果：
1.pH值、光照和矿化度对聚丙烯酰胺的粘度影响较大，聚丙烯酰胺降解菌的筛选及降解含聚丙烯酰胺污水的室内研究,而对于聚丙烯酰胺 的浓度影响较小。低温和弱的机械剪切对聚丙烯酰胺的粘度和浓度影响都不大， 而高温和强的机械剪切对聚丙烯酰胺的粘度和浓度影响都比较大。对聚丙烯酰胺 的评价方法进行了优化，以浓度评价聚丙烯酰胺降解为主，粘度和分子量评价为 辅；在浓度评价方法中采用淀粉-碘化镉法，并对其测定条件中的缓冲溶液的pH 值进行了优化，测定的缓冲溶液的最佳pH值为3.5。
2.初步筛选到三株好氧的聚丙烯酰胺降解菌种，分别命名为PM-2、PM-3、
PM-4。通过生理生化性质和16S rDNA鉴定，PM-2为蜡样芽胞杆菌，PM-3为枯
草芽孢杆菌，PM-4为苍白杆菌。将三株菌进行混合正交培养后，优化出PM-2 与PM-3的混合菌降解效果最好，300 mg"L-1聚丙烯酰胺溶液的降解率最高可达到 42%。优化了混合菌降解条件，最佳降解时间为3天，连续活化次数为4次，接 种体积分数为3 %，温度为35 - 45 °C，初始pH值为6.0-7.5，摇床转速为140 r-min-1，矿化度为 2500 -10000 mg-L-1。
3.探讨了细菌对聚丙烯酰胺的利用情况，结果表明聚丙烯酰胺既可以作为 氮源利用也可以作为碳源利用，通过扫描电镜、红外分析、差热分析、紫外分析 以及液相分析等手段对生物降解前后的样品的表征的基础上对微生物好氧降解 聚丙烯酰胺的机理进行了初探。在其分泌的胞外酰胺酶的作用下聚丙烯酰胺先被 作为氮源利用，在其生长和代谢过程中，聚丙烯酰胺被断裂为小分子有机物，又 可以作为碳源被细菌利用。
4.在对含聚污水水质分析和可生化性分析的基础上对污水进行可生化性调 整。运用生物接触氧化法对污水进行了生化处理模拟实验。模拟实验分为静态模 拟和动态模拟两部分进行。静态模拟实验中，降解7天后，聚丙烯酰胺降解率达 到80 %，原油总的去除率为95 %，COD&的总的去除率达到86 %。动态模拟 试验中，生化处理3天以后，出水的各项指标趋于稳定，聚丙烯酰胺的降解率达 到67 %，原油总的去除率为93 %，出水的COD&总的去除率达到80 %。
部分水解聚丙烯酰胺（partially hydrolyzed polyacrylamide，HPAM)以其相
对高分子量和低浓度水溶液的高粘性而被广泛用来提高原油的采收率 。近年 来，我国东部的大多数油田基本上已经进入高含水开发后期，使用HPAM进行 三次采油已经得到广泛地应用。随着聚合物驱油技术在我国油田的大面积推广， 含聚丙烯酰胺污水的产量在逐年增加。聚丙烯酰胺在为油田生产提高原油采收率 的同时，也大幅度增加了混合液的粘度和乳化性，使油水分离难度加大，造成采 出水含油量严重超标。含聚丙烯酰胺污水具有粘度高、油水分离难度大、可生化 性差等特点，对环境的负面影响也越来越明显。含聚污水的处理已经成了一个亟 待解决的问题。然而现有工艺无法满足处理要求，需要对聚丙烯酰胺降解的途径 和机理进行全面深入地研究，寻找合适的处理方法。
作为对环境污染物高效的处理手段，由于其技术上的成熟、无二次污染和其 低廉的运行费用，微生物降解与处理工艺已经在各种难降解污染物的无害化处理 领域发挥着核心作用。微生物降解与其特有的无害化处理将成为解决聚丙烯酰胺 引起环境污染和转化的潜在毒性问题的有效手段[2]。
本论文是以胜利油田含聚污水为研究对象，初步筛选出对聚丙烯酰胺具有一 定降解能力的菌种，并应用于室内生化模拟实验。论文研究将为油田含聚污水的 达标处理回注奠定理论基础，为油田可持续发展提供技术支撑；同时也为近海油 田的采出污水的处理提供借鉴，对海洋环境的保护也有一定的现实意义。
1研究背景
1.1聚丙烯酰胺的简介
聚丙烯酰胺是丙烯酰胺及其衍生物的均聚物和共聚物的统称[3]。
1.1.1聚丙烯酰胺的发展历史
聚丙烯酰胺(polyacrylamide，PAM)最早在1893年由Moureu用丙烯酰氯与 氨反应制得的。1954年首先在美国实现商业化生产。当时，丙烯酰胺（acrylamide， AM)是由丙烯腈（acrylonitrile，AN)经硫酸水合而得。70年代以来，随着AM 的第二代技术生产技术——催化水合法，及第三代生产技术——微生物法相继问 世，PAM系列产品不断被开发，PAM生产技术也不断发展和进步。
从品种上讲，最先实现的是非离子聚丙烯酰胺（nonionic polyacrylamide， NPAM)随后出现的是部分水解聚丙烯酰胺（HPAM)。20世纪70年代，美国 Merck公司和Halliborton公司首先研制成功阳离子聚丙烯酰胺（cation
polyacrylamide，CPAM)二甲基二烯丙基氯化铵均聚物（polydimethyldiallyl
ammoniumchloride，PDMDAAC)和二甲基二烯丙基氯化铵与丙烯酰胺共聚物（P (DMDAAC/AM))，并很快投入工业化生产。到1980年，在日本随着阳离子单 体丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵（acryloxyethyl trimethylammonium chloride， AETAC)开发成功，AETAC的均聚物和共聚物阳离子聚丙烯酰胺（PAETAC， P(AETAC/AM))也相继投入生产，到1987年全日本的生产能力已经达到17750 t-a-1。到 1990 年代，两性聚丙烯酰胺（amphoteric polyacrylamide，AmPAM)的 研究趋于活跃，不久AmPAM就进入市场并被广泛应用。到目前，丙烯酰胺和丙 烯酰胺衍生物的均聚物和共聚物品种数以不下百种，新的品种还在不断地被开发 出来。
PAM的优良的水溶性、增稠性、絮凝性、化学反应活性、以及经过改性产品 的多样性，使PAM显示出广阔的应用前景和巨大的市场潜力。在此刺激下，从上 个世纪50年代以来，有关PAM的研究与开发非常活跃，其工业产品剂型从最初
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的水溶胶、发展到粉剂、乳液（油包水乳液)、水分散型（又称水包水乳液）等[4]。 1.1.2聚丙烯酰胺的结构式
按水溶性分类，聚丙烯酰胺分为两种。一种为线性的、水溶性的聚丙烯酰胺， 一种交联的、非水溶性的但能包含吸收大量水的聚丙烯酰胺（聚丙烯酰胺凝胶）。
聚丙烯酰胺凝胶，是以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联成的，聚丙烯酰胺降解菌的筛选及降解含聚丙烯酰胺污水的室内研究,经干 燥粉碎或加工成型制成粒状，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶，交联剂 越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝胶的商品为生物胶一P (Bio-Gel P)，有日本tosoh 的TSKGEL的pw系列，适合蛋白和多糖的纯化，即丙烯酰胺和少量交联剂甲叉双 丙烯酰胺，在催化剂过硫酸铵作用下聚合形成凝胶。其结构式如下[5]:
图1-1交联聚丙烯酰胺凝胶结构式 Fig.1-1 Structural formula of crosslinked polyacrylamide gel
线性的聚丙烯酰胺亲水性高，能以各种百分比溶于水，不溶于大多数有机溶 液。它是应用最广泛的水溶性高分子化合物之一。如下图所示：
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图1-2—种线性聚丙烯酰胺的结构式 Fig.1-2 Structural formula of a linear polyacrylamide
按电性分类，聚丙烯酰胺有非离子型、阴离子型、阳离子型和两性离子型。
H H
I I
C—C-
H
U
O
I
NH
2
(1)非离子型（均聚物）
非离子聚丙烯酰胺（NPAM)由丙烯酰胺单体聚合制得。
(2)阴离子型（共聚物）
H H
I I
C—C
H卜〇 NH2
HH
1 1
■C—C ——
I I
H ?=〇
OH-
门
由非离子型聚丙烯酰胺水解或丙烯酰胺与丙烯酸共聚制得。
阴离子聚丙烯酰胺（APAM)的分子量从600万到2500万水溶解性好，能 以任意比例溶解于水且不溶于有机溶剂。有效的pH值范围为7到14,在中性碱 性介质中呈高聚合物电解质的特性，与盐类电解质敏感，与高价金属离子能交联 成不溶性凝胶体。阴离子型聚丙烯酰胺习惯上也称为部分水解聚丙烯酰胺 (HPAM)。
(3)阳离子型（共聚物）
由丙烯酰胺(AM)与二烯丙基二甲基氯化铵(DADMAC)、丙烯酰氧乙基三甲 基氯化铵(AETAC)等其他单体共聚制得。
4
:〇
NH
2
n
NHCH2NR2.HCl
阳离子聚丙烯酰胺（CPAM)的分子量从800万到1500万。离子度从20 % 到55 %水溶解性好，能以任意比例溶解于水且不溶于有机溶剂。有效的PH值 范围为1到14，呈高聚合物电解质的特性。
(4)两性离子型（共聚物）
H H
I I
C—C—
C 一
HC—
NH2
HH
C—C —
I l_
H C一〇 OH-
H
H
C 一 C=O
」
NHCH2NR2.HCl
两性离子聚丙烯酰胺就是分子内即含阳离子基又含有阴离子基。
两性离子聚丙烯酰胺（AmPAM)因分子内含阳离子基和阴离子基，它具备 了一般阳离子絮凝剂的使用特点外，表现了更优异的性能。可在大范围的pH值 内使用，具有更高的滤水量，较底的滤饼含水率。两性离子型绝非阴离子型、阳 离子型的混合。如果把阳离子聚丙烯酰胺与阴离子聚丙烯酰胺配合使用则会发生 反应产生沉淀。所以两性离子产品最为理想 。
1.1.3聚丙烯酰胺的应用
由于聚丙烯酰胺具有高分子化合物的水溶性以及其主链上活泼的酰基，因而 在石油开采、水处理、纺织印染、造纸、选矿、洗煤、医药、制糖、养殖、建材、 农业等行业具有广泛的应用，有“百业助剂”、“万能产品”之称[7]。
1)水处理领域
PAM在水处理工业中的应用主要包括原水处理、污水处理和工业水处理3 个方面。在原水处理中，PAM与活性炭等配合使用，可用于生活水中悬浮颗粒 的凝聚和澄清；在污水处理中，PAM可用于污泥脱水；在工业水处理中，主要 用作配方药剂。在原水处理中，用有机絮凝剂PAM代替无机絮凝剂，即使不改
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造沉降池，净水能力也可提高20 %以上。所以目前许多大中城市在供水紧张或 水质较差时，都采用PAM作为补充。在污水处理中，采用PAM可以增加水回 用循环的使用率。
2)石油采油领域
在石油开采中，主要用于钻井泥浆材料以及提高采油率等方面，广泛应用于 钻井、完井、固井、压裂、强化采油等油田开采作业中，具有增粘、降滤失、流 变调节、胶凝、分流、剖面调整等功能。目前我国油田开采已经步入中后期，为 提高原油采收率，目前主要推广聚合物驱油和三元复合驱油技术。通过注入聚丙 烯酰胺水溶液，改善油水流速比，使采出物中原油含量提高。目前国外聚丙烯酰 胺在油田方面的应用不多，我国由于特殊的地质条件，大庆油田和胜利油田已经 开始广泛采用聚合物驱油技术。
3)造纸领域
PAM在造纸领域中广泛用作驻留剂、助滤剂、均度剂等。它的作用是能够 提高纸张的质量，提高浆料脱水性能，提高细小纤维及填料的留着率，减少原材 料的消耗以及对环境的污染等。在造纸中使用的效果取决于其平均分子量、离子 性质、离子强度及其它共聚物的活性。非离子型PAM主要用于提高纸浆的滤性， 增加干纸强度，提高纤维及填料的留着率；阴离子型共聚物主要用作纸张的干湿 增强剂和驻留剂；阳离子型共聚物主要用于造纸废水处理和助滤作用，另外对于 提高填料的留着率也有较好的效果。此外，PAM还应用于造纸废水处理和纤维 回收。
4)纺织印染工业
在纺织工业中，PAM作为织物后处理的上浆剂、整理剂，可以生成柔顺、 防皱、耐霉菌的保护层。利用它的吸湿性强的特点，能减少纺细纱时的断线率； PAM作后处理剂可以防止织物的静电和阻燃；用作印染助剂时，可使产品附着 牢度大、鲜艳度高，还可以作为漂白的非硅高分子稳定剂；此外，还可以用于纺 织印染污水的高效净化。
5)其他领域
在采矿、洗煤领域，采用PAM作絮凝剂可促进采矿、洗煤回收水中固体物 的沉降，使水澄清，同时可回收有用的固体颗粒，避免对环境造成污染；在制糖 6 工业中，可加速蔗汁中细粒子的下沉，促进过滤和提高滤液的清澈度；在养殖工 业中，可改善水质，增加水的透光性能，从而改善水的光合作用；在医药工业中， 可用作分离抗菌素的絮凝剂、用作药片的赋型粘接剂以及工艺水澄清剂等；在建 材工业中，可用作涂料增稠分散剂、锯石板材冷却剂以及陶瓷粘接剂等；在农业 上，可作为高吸水性材料可用作土壤保湿剂以及种子培养剂等。在建筑工业中， 可以增强石膏水泥的硬度，加速石棉水泥的脱水速度。此外，还可用作天然或合 成皮革的保护涂层以及无机肥料的造粒助剂等。
1.2聚丙烯酰胺在油田提高采收率的应用
广泛用于油田提高原油采收率聚丙烯酰胺的产品为阴离子的水溶性部分水 解聚丙烯酰胺（HPAM)。
在我国能源日趋紧张的情况下，石油能源的合理开发利用已引起人们的极大 重视，因此，提高采油率已成为石油开采研究的重大课题。我国国内主要油田都 进入开发后期，含水率迅速上升，现有的注水技术已难以满足油田的需要。聚合 物驱三次采油日趋成为提高采收率的一个重要方法[8]。
1.2.1聚合物驱油
通常把利用油层能量开采石油称为一次采油；而在一次采油后，通过注水或 非混相注气提高油层压力并驱替油层中原油的驱油方式称为二次采油；而在利用 天然能量进行开采和传统的用人工增补能量(注水、注气)之后，利用物理的、化 学的、生物的新技术来改善油、气、水及岩石相互之间的性能进行尾矿采油的开 发方式，称为三次采油。目前世界上已形成三次采油的四大技术系列，即化学驱、 气驱、热力驱和微生物采油。其中化学驱包括聚合物驱、表面活性剂驱、碱水驱 及其复配的三元复合驱等[9]。
各种提高采收率方法中，聚合物驱油是目前潜力最大、具备工业化试验和推 广生产的主要方法，可以经济、有效地提高原油采收率；周期短，见效快；聚合 物驱以扩大波及体积为主，因此它更适用于非均质的中质或较重质的油藏；油藏 渗透率高，利于聚合物驱；适用的油藏原油粘度范围一般约为5-60 mPa_s[10]。
聚合物驱油在美国始于20世纪50年代末，从70年代到80年代中期，美国
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共进行聚合物驱矿场试验183次，采收率最高提高8.6 %。此外，在前苏联的奥 尔良油田和阿尔兰油田、加拿大的HorseflyLake油田和Rapdan油田、法国的 Chatearenard油田和Courtenay试验区及德国、阿曼等，也都进行了聚合物驱油工 业性试验，一般提高原油采收率6 %〜17 %[11]。
国内的三次采油技术在20世纪90年代发展很快，继大庆油田之后,胜利、 大港、河南、辽河等油田也都进行了先导性试验，并取得了成功。其中，大庆油 田、胜利油田等大型油田已形成注聚采油的规模生产,2003年大庆油田聚合物驱 油生产原油已达到年产1000万吨以上。2005年，胜利油田聚合物驱三次采油累 积增油1000万吨。目前，我国大型油田已成为聚丙烯酰胺的最大应用领域[12]。
聚合物驱油是通过在注入水中加入一定量的高相对分子质量的聚丙烯酰胺 (一般是阴离子型的），增加注入水的粘度，改善油水流度比，延缓油井含水率 的上升速度，从而改善油藏开采效果，提高油田采收率。
聚丙烯酰胺水溶液作驱油剂又叫稠化水驱或增粘水驱。其驱替机理主要是通 过减少水油的流度比，减少水的指进，达到活塞式驱替，以提高驱油剂的波及指 数，从而提高油层的采收率[13]。
聚合物分子是一种柔性大分子，在油层多孔介质中驱油时可形成长链状或团 状，它与原油的作用，是通过C-H键和外部H原子与油膜表面分子的摩擦和碰撞 而发生的。在聚合物驱油过程中，由于分子的相互粘连、碰撞而使聚合物分子不 断储存和释放弹性能，使更多的不动油变为可动油，从而提高驱油效率。一般情 况下在与水驱相同的流速下，聚合物分子与岩石、油滴、油膜界面分子的相互作 用，使其C-H键上存储有弹性能，而使表面原子与原油分子发生作用力更大的碰 撞，从而使更多的原油分子从油相上分离并与注入剂一起在溶液中运动。聚合物 分子的弹性能越大，驱动原油的力就会越大。随着聚合物溶液流速的增高，聚合 物分子对原油分子的冲击和碰撞加剧，摩擦力也增大，从而使驱油效率增高[14]。
1.2.2聚合物驱油存在的问题
虽然聚合物驱已形成了较为完善的配套工艺技术，但遇到的问题也逐渐增 多。聚丙烯酰胺高温易水解，高温高盐情况下易从溶液中沉淀出来，溶液粘度对 温度和盐度非常敏感，在高温高盐环境中溶液的保留粘度很低，受地层的剪切作
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用粘度下降也很大[15]。所以，聚丙烯酰胺降解菌的筛选及降解含聚丙烯酰胺污水的室内研究,聚合物溶液粘度的稳定性一直是影响聚合物驱的 关键问题[16]。
另外，这种方法需要的地面设施复杂，要建注聚站；微量污染和凝胶会引起 地层堵塞；聚合物驱后油藏的渗透率降低；注入的聚合物质量要求高，与地层水 及其添加剂配伍性好，要有长期的热稳定性、化学稳定性和生物稳定性；对于高 温高盐油田，实施聚合物驱困难和风险较大[17]。
同时，在聚合物驱油大力推广时，也有些矿场试验没成功，其原因很多，可 动油饱和度低、原油粘度高以及地面处理问题等，其中水质不达标也是造成矿场 试验失败的一个重要因素[18-19].
1.2.3聚合物驱油对环境的危害
聚丙烯酰胺在为油田生产提高采收率的同时，对其采出液的处理遇到很大问 题。注入地层的聚丙烯酰胺随原油/水混合液进入地面油水分离与水处理终端， 大幅提高了混合液的粘度和乳化性，使油水分离难度加大，造成采出水含油量严 重超标。聚丙烯酰胺对环境的直接影响是油田生产过程中部分污水外排。由于油 田配制聚丙烯酰胺需要新鲜水和以及部分低渗透地层，使部分含有较高浓度的聚 丙烯酰胺采出水外排。绝大多数的聚丙烯酰胺进入地下油层，由于地层结构原因， 很难避免其渗透到地下水层。聚丙烯酰胺在地面水体和地下水中的长期滞留，必 将对当地水环境造成潜在的危害[12]。
聚丙烯酰胺本身是安全无毒的，但是其单体丙烯酰胺是一种有毒化学物质， 对其毒性国内外已经进行了大量的研究[2〇]。对于环境中的丙烯酰胺浓度各国都 有相应的法律法规：美国职业安全与卫生法(OSHA)规定职业接触标准是空气中 丙烯酰胺的阈值-时间加权平均(TLA - TWA)为0.3 mg-m-3 [21];英国规定饮料中丙 烯酰胺含量< 0.25X10-6 g.L-1 [22]；日本规定向河水中排放丙烯酰胺含量< 10x10-6 g-L-1；我国费渭泉等提出，丙烯酰胺在水中的剩余浓度< 10x10-6g.L-1。由于其 良好的水溶性，排入环境的丙烯酰胺基本上进入地面水体和地下水中[12,23]。
丙烯酰胺长期与皮肤接触可引起皮炎，直接接触可引起眼睛发炎；过分曝露 于高浓度蒸汽700 mg_kg-1中导致眼睛和呼吸道感染，会引起头痛、头昏、嗜睡和 对其他中枢神经系统造成影响甚至死亡，吸入微量丙烯酰胺会引起严重的肺部伤
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害甚至死亡。动物试验结果显示，丙烯酰胺是一种可能致癌物。职业接触人群的 流行病学观察表明，长期低剂量接触丙烯酰胺会出现嗜睡、情绪和记忆改变、幻 觉和震颤等症状，伴随末梢神经病（手套样感觉、出汗和肌肉无力）[24]。
残留在环境中的聚丙烯酰胺会发生缓慢降解，包括物理降解（热降解、机械 剪切作用）、化学降解（水解、氧化以及催化氧化）和生物降解（微生物酶解）[7]， 释放出有毒的丙烯酰胺单体，这将给当地环境带来巨大的长期的影响。
1.3聚合物驱油产出污水的处理
目前，聚丙烯酰胺的应用范围和规模正呈现快速增长趋势，同时其在环境中 的累积、迁移、转化带来的毒性亦将逐渐显露出来，并将给生态环境带来不可估 量的长期危害。因此，含聚污水的处理成为亟待解决的问题。
对于含聚污水处理技术主要包括物理方法、化学方法和生物方法。
1.3.1物理方法
物理法处理技术就是采油含聚污水经预处理，在沉降罐中经自然沉降，除去 浮油及大颗粒杂质，再经粗粒化，进行二次沉降和过滤，除去细小油滴及未沉降 的悬浮物[25]。单纯的物理方法对于含聚污水的处理根本达不到油田回注水的指 标，而且对残余的聚丙烯酰胺未作任何处理，对于环境的危害仍然存在。
1.3.2化学方法
处理含聚污水化学方法主要有添加化学助剂絮凝沉降法和氧化法（传统氧化 法、催化氧化法和电化学方法）。
添加破乳剂、浮选剂和絮凝剂絮凝沉降是目前实际应用中较多的手段，它与 物理方法结合能有效去除污水机杂和油滴。其中，阳离子聚丙烯酰胺处理含聚污 水具有良好的效果。其缺点：一是药剂价格太高导致现场运行成本高；二是絮凝 废弃物无法处理，二次污染环境[26]。
氧化法其原理是利用强氧化剂、光能或其他能量催化产生自由基引发自由基 的连锁反应使长的聚丙烯酰胺分子链断裂变成小分子有机物，最终被氧化降解为 无机物。目前研究较多的氧化剂有Fenton试剂[27]、高铁酸钾[28]等。催化氧化法有
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非均相光催化法[29]和多相催化氧化法[30]，此外，陈武等[31]研究使用电化学方法
去除聚丙烯酰胺。
传统的氧化方法只能将聚丙烯酰胺转化为小分子有机物，但污水的COD值 却没有明显下降。其一次投资和运行费用高，且易造成二次污染。电化学方法尚 处于实验研究阶段；光催化降解可在常温、常压下进行，光催化技术能彻底破坏 聚丙烯酰胺，不产生二次污染。且费用较低，能除去低浓度的聚丙烯酰胺，是一 种潜在的、非常有发展前途的、对环境友好的含聚污水处理技术[29]。
1.3.3生物方法
生物方法处理含聚污水主要是利用微生物通过其特定酶的作用，以聚丙烯酰 胺为营养源，在其生长和代谢过程中将聚丙烯酰胺转化为小分子有机物和无机 物。微生物对聚丙烯酰胺的降解分为好氧和厌氧两个过程。好氧分解是以聚丙烯 酰胺的酰胺基为氮源，在其生长过程中，将大分子的聚合物降解为小分子的有机 物，进而利用小分子有机物为碳源对其进行彻底降解。厌氧分解是在厌氧环境中， 部分水解聚丙烯酰胺的酰胺基或羧基被还原为醛或醇，在此过程中，长链分子断 裂为更易被微生物利用的短链分子，并最终降解为对环境友好的物质。
作为对环境污染物高效的处理手段，由于其技术上的成熟、无二次污染和其 低廉的运行费用，微生物降解与处理工艺已经在各种难降解污染物的无害化处理 领域发挥着核心作用。已有研究结果表明，在聚丙烯酰胺的转化过程中，生物催 化、氧化扮演了重要作用。由于微生物特殊的环境适应性、高繁殖速率和变异性, 微生物降解与无害化将成为解决聚丙烯酰胺引起环境污染和转化的潜在毒性问 题的有效手段[2]。
但目前对以聚丙烯酰胺为底物的生物降解研究比较少，已公开的聚丙烯酰胺 的生物降解率都比较低，寻找高效降解聚丙烯酰胺的微生物是研究者下一步的工 作目标。
1.4生物降解聚丙烯酰胺的研究进展
对聚丙烯酰胺的生物降解最早由1978年Suzuki等[32]研究开始的。研究者对 聚丙烯酰胺的降解大都集中在聚丙烯酰胺能否被降解以及是被微生物作为碳源
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还是作为氮源利用这几个方面。大多数研究者认为聚丙烯酰胺不能被微生物完全 降解，只能被部分降解。即使被氧化或光降解后的小分子量的聚丙烯酰胺也具有 很强的生物抗性。
由于聚丙烯酰胺在国外很少用于油田聚合物驱油，而用于灌溉田中保持土壤 中的水分和作为絮凝剂的应用很广泛，所以国外研究者的研究一般集中在聚丙烯 酰胺在土壤中的应用对于微生物群落和土壤生态环境的影响以及作为絮凝剂沉 淀后的废渣对存放处环境的影响。在国内，最早由1999年黄峰等研究了硫酸盐 还原菌对聚丙烯酰胺的降解[33-35]。由于聚合物驱在油田的大范围使用以及含聚污 水的逐年增加，国内研究者对于含聚丙烯酰胺污水的处理研究逐渐增多。但总体 来看，对聚丙烯酰胺的生物降解研究仍处于初步阶段。
1.4.1降解聚丙烯酰胺的典型种群
表1是国内外研究者筛选出的能降解聚丙烯酰胺的微生物种群。由表中可以 看出降解聚丙烯酰胺的微生物种类比较丰富，有细菌、放线菌、古菌和真菌等。
表1聚丙烯酿胺降解菌的典型种群 Table 1 The typical strains of HPAM-biodegradation
降解菌种群研究者描述的菌种形态菌种出处研究者
产碱假单胞菌单个狭长的近椭圆状，极 生多鞭毛，革兰氏阴性， 好氧。大庆油田含聚废水驯化的 好氧颗粒污泥孙晓君等[36]
PM-1芽孢杆菌属胜利油田聚丙烯酰胺驱油 产出液包木太等[37]
假单胞菌属菌株 PD-1杆状，革兰氏阴性菌大庆油田聚丙烯酰胺驱油 产出液李蔚等[38]
硫酸盐还原菌—油田现场取样黄峰等[33-35] El-Mamouni
等間，
程林波等[56]
腐生囷—油田现场取样黄峰等[40]
黄孢原毛平革菌—实验室自备韩昌福等[41]
白腐真菌————实验室自备Sutherland
12
等[42]
该菌细胞呈直杆状芽孢
褐栗芽孢杆菌 JHW-L椭圆中生，菌落湿润，浅 栗褐色，不透明，革兰氏 染色阳性，属于兼性厌氧筛选自大庆油田含HPAM 的产出液刘永建等[43]
细菌
Enterobacter HPAM Degraded 巳acteria I8该菌株为短杆状，革兰氏 阴性，黑色圆形菌落表面 凸起、光滑、边缘整齐，大庆油田六厂喇I聚合物 配注站魏利等[44]
兼性厌氧
Clostridium.杆状，黑色圆形菌落，为大庆油田采油五厂十三区魏利等[45]
stickland CMW梭菌属的新种聚合物配注站的母液罐
Anaerofilum pen-tosovorans A9革兰氏阳性，短杆状，具 有硫酸盐还原功能，产 H2S，兼性厌氧大庆油田常规污水回注工 艺采油的采出液魏利等[46]
降解菌G1—天津市工业微生物研究所 保藏菌种高年发等[47]
2株降解菌A和BA为成团杆菌，兼性厌氧； B为巨胞氮单胞菌，好氧日本北海道大学校园Kunichika N 等[48]
3株兼性菌编号分别 为ML1、ML2和ML3ML1属于假单胞菌属，ML2 和ML3属于梭状芽孢杆菌
属某油田含聚合物产出水李宜强等[49]
JHW-1和JJH属于芽孢杆
4 株 JHW-1、JHW-3、菌属，JHW-3属于梭状芽大庆油田聚丙烯酰胺驱油郝春雷等[50]
JJF、JJH孢杆菌属，JJF属于假单产出液
胞杆菌属
SHB，MRT，P178， PHL和gwn5菌株菌种的大小为0.8〜 2.0叫，形态有棒状、节
杆等，属兼性厌氧菌。大庆油田各采油厂聚合物 区块廖广志等[51]
13
七株HPAM降解菌分别归类于放线杆菌纲， a-变形菌纲和芽孢杆菌某污水处理厂曝气池佘跃惠等[52]
17株混合菌HC-1、HC-2、HC-3、HC-4、 HC-6、HC-7、HC-9、 HC-11、HC-12、HC-13、 HC-14、HC-15、HC-17南阳采油一厂注聚联合站 的含聚合物废水和该站配高玉格等[53]
为芽孢杆菌属；HC-8为 节细菌属;HC-5和HC-16
为黄杆菌属；HC-10为不
动细菌属制聚丙烯酰胺溶液所清除 的罐底污泥中
1.4.2复合菌的优势
在研究微生物对某种有机物的降解过程的时候，往往采用单菌落降解。但是 随着各种冷却剂、增塑剂、杀虫剂和防腐剂等化学添加剂的广泛应用，越来越多 合成的、有毒的、难降解的物质进入了环境当中。这些物质往往会对微生物的降 解表现出较强的抵抗作用，HPAM也是如此，主要原因可能是单一的微生物不具 备单独降解这些难降解化合物的代谢能力[54]，而需要借助微生物或群落间的协 同作用。
董春娟等[54]研究认为微生物群落可以通过对难降解物质的协调利用、共代 谢和转移中间产物等途径达到对难降解物质的生物降解。在协调作用中，单菌种 不具备一整套完整的酶系统或基因成分来降解那些难降解的有机物，而微生物群 落中不同基因的拥有者却可能发生基因交换或重组，从而导致新的降解途径的实 现。对难降解物质，有些能在单纯厌氧微生物作用下降解；有些需经厌氧水解提 高污染物的生物可降解性，再被好氧微生物最终降解；而有些需在同一体系中经 历一系列好氧、厌氧过程才能降解。聚丙烯酰胺降解菌的筛选及降解含聚丙烯酰胺污水的室内研究,所以有必要对各种微生物生态系统、微生物 群落及其环境进一步研究。
佘跃惠等[52]将7株HPAM降解菌混合在一起，研究由他们组成的群落对 HPAM的降解情况和对含HPAM废水的处理情况，探究了它们的降解机理。由于 配制培养基所用的HPAM为超高分子量的聚合物（分子量为1.6 xl〇6 )，一般说 来，它们不能直接透过细胞壁被微生物利用。所以这7株菌中，至少有一株是能
14
够产生胞外酶的。通过胞外酶的作用，先对HPAM进行水解或者使其断链而降 低分子量，从而可以被微生物进一步的降解。文献中指出，混合菌可能具有协调 机制，从而提高了降解效果。微生物可能并不是以HPAM为碳源，但同样可以引 起HPAM的降解，可能是微生物的群落效应，在存在合适底物的时候，群落中的 一些微生物会以这些底物为营养而生长，但其代谢产物或其代谢产生的某些酶会 间接的与HPAM发生相互作用，从而导致HPAM的水解或断链，而这些产物又可 以被其他的微生物所利用，从而导致了 HPAM的降解[55]。但是具体的降解机理文 献中并没有指出，已查阅的其他相关文献，也鲜有关于混合菌协同降解机理的研 究。
聚丙烯酰胺驱油的采出液中，不仅含有聚丙烯酰胺，而且还含有原油。如何 对这两种成分同时进行有效分解，减少环境污染带来的压力，是聚丙烯酰胺使用 者在聚丙烯酰胺驱油中非常关注的问题。目前筛选出的菌种大部分只能单一的降 解原油或聚丙烯酰胺，所以急需解决的问题之一便是筛选出对原油和聚丙烯酰胺 都能高效降解的菌种。
1.4.3同时降解石油烃和聚丙烯酰胺的菌种
李蔚等[38]从大庆油田聚丙烯酰胺驱油采出液中筛选出了一株聚丙烯酰胺降 解菌，同时对原油有降解作用。廖广志等[51]从大庆油田各采油厂聚合物区块筛 选优化出能在聚合物和原油存在的条件下生长繁殖的5株混合菌，对原油和聚丙 烯酰胺都有显著降解作用。
由于聚丙烯酰胺的高分子量和高粘度的特性，能降解聚丙烯酰胺的菌种对原 油有一定程度的降解，而能降解原油的菌株经驯化或基因诱变后对聚丙烯酰胺可 能具有降解作用。我们可利用已知烃降解菌，经驯化或基因诱变后考察对聚丙烯 酰胺的降解作用，是研究者今后的一个研究方向。
1.5论文研究内容及实验技术路线框图
随着聚合物驱油在我国的大面积推广与应用，含聚丙烯酰胺污水的数量在逐 年增加，这使得含聚合物污水的处理研究已经迫在眉睫，其中最核心的问题便是 HPAM的降解。传统的氧化方法的缺陷和光催化技术的不成熟以及微生物本身的
15
特殊优势将使微生物降解成为解决聚丙烯酰胺引起的环境问题的有效手段。目 前，微生物降解HPAM研究已经取得了一些成果，但研究仍处于初步阶段。本论 文将以下几方面进行进一步探索：
(1)寻找筛选高效降解聚丙烯酰胺的菌种，并对其降解进行深入研究。
(2)复合菌因可能具有协调机制，具有较高降解效果，筛选高效复合菌以 及研究其降解机理是本论文探索的一个方向。
(3)由于油田含聚污水为原油和聚丙烯酰胺的混合体系，考察菌种同时对 聚丙烯酰胺和原油的降解效果是本论文探索的又一个方向。
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实验技术路线框图:
17
2聚丙烯酰胺的性质考察及评价方法优化
部分水解聚丙烯酰胺（HPAM)目前被广泛应用于油田三次采油中，利用 HPAM作为聚合物驱对提高石油采收率的效果明显，已成为是中后期油田生产中 至关重要的一环[58]。研究影响HPAM溶液稳定性的因素，对充分掌握该聚合物的 性质尤为重要，也是考察聚丙烯酰胺降解的重要参考依据。
2.1聚丙烯酰胺理化性质的测定
聚丙烯酰胺在空气中容易吸潮，通过在干燥箱中烘干，除去所吸水分，从而 评价其干重。水解度的测定是使用甲基橙-靛蓝二磺酸钠为指示剂，用盐酸标准 溶液滴定。分子量的测定是使用乌氏粘度计测定其粘均分子量。使用布式粘度计 测定其动力粘度，用乌氏粘度计测定其运动粘度。使用淀粉-碘化镉光度法对聚 丙烯酰胺的浓度进行了测定。
2.1.1仪器与试剂
2.1.1.1主要试剂
聚丙烯酰胺（山东东营市长安聚合物集团公司）
冰醋酸（A.R，500 mL)，天津广成化学试剂有限公司 Ab(SO4)3.18H2〇 (A.R，500 g)，天津博迪化工有限公司 Cdl2 (A.R，500 g)，上海试剂二厂 甲酸钠（A.R，500 g)，天津市科密欧化学试剂有限公司 可溶性淀粉（A.R，500 g)，天津巴斯夫化工有限公司 溴水（A.R，500 mL)，天津大茂化学试剂厂 盐酸（A.R，500 mL)，天津市耀华化学试剂有限公司 甲基橙（A.R，25 g)，天津市瑞金特化学品有限公司 靛蓝二磺酸钠（A.R，25 g)，天津市博迪化工有限公司 2.1.1.2主要仪器
BP221 Sartorius万分之一电子分析天平日本岛津
18
上海山连实验设备有限公司 成都仪器厂 成都仪器厂 北京仪器厂 上海第三仪器厂
DHG-9053电热鼓风干燥箱
HSS-1数字超级恒温水浴槽 NDJ-99旋转粘度计 乌氏粘度计（内径0.58 mm) 721型分光光度计
另有：干燥器、称量瓶、酸式滴定管、250 mL锥形瓶、50 mL比色管、移 液管（1ml、5 ml、10 ml、15 ml、25 ml)各若干。
2.1.2实验方法
2.1.2.1聚丙烯酰胺固含量的测定方法
将精确称重的聚丙烯酰胺样品放入预先称重的称量瓶中，然后将其放入105 ±1°C的干燥箱中，干燥90min后取出，放入干燥器中冷却称重。
固含量：S=(Z-X)/(Y-X) X100%(2-1)
式中：S固含量，°%; X称量瓶重，g; Y称量瓶与湿样重，g;
Z称量瓶与干样重，g
2.1.2.2聚丙烯酰胺水解度的测定方法
先将聚合物样品溶于蒸馏水中，使其浓度为1000 mg/L。用移液管移取10.00 mL已溶解好聚合物溶液于250 mL锥形瓶中，加10 mL蒸馈水，搅拌均勻。再向 锥形瓶中加2滴甲基橙指示液、2滴靛蓝二磺酸钠指示液，摇动均匀，此时溶液 呈黄绿色。用0.1000 mol/L盐酸标准溶液滴定。溶液由黄绿色变为浅灰色即为终 点（如变成紫色，则表示滴过终点）。平行测定相对误差小于±0.5 %[59]。
水解度：A=71 MV/(1000WS-23MV) X100%(2-2)
式中：A水解度，％; M盐酸标准溶液的摩尔浓度，mol/L; V消耗
的盐酸体积，mL; W——聚合物样品的质量，g。S——聚丙烯酰胺的固含量， %。
2.1.2.3聚丙烯酰胺粘均分子量的测定方法 测定步骤如下[60]:
(1)先用洗液将粘度计洗净，再用自来水、蒸馏水分别冲洗几次，每次都要注意 反复冲洗毛细管部分，洗好后烘干备用。
19
(2)调节恒温槽温度至(30.0±0.1) °C，在粘度计的B管和C管上都套上橡皮管， 然后将其垂直放入恒温槽，使水面完全浸没1球。
(3)用移液管分别吸取已知浓度的聚丙烯酰胺溶液10 mL和NaN〇3溶液(3 mol.L-1)5 mL，由A管注入粘度计中，在C管处用洗耳球打气，使溶液混合均匀， 浓度记为G，恒温10 min，进行测定。测定方法如下：将C管用夹子夹紧使之不 通气，在B管用洗耳球将溶液从4球经3球、毛细管、2球抽至1球2/3处，解 去夹子，让C管通大气，此时3球内的溶液即回入4球，使毛细管以上的液体悬 空。毛细管以上的液体下落，当液面流经a刻度时，立即按停表开始记时间，当 液面降至b刻度时，再按停表，测得刻度a、b之间的液体流经毛细管所需时间。
重复这一操作至少三次，它们间相差不大于0.3 s，取三次的平均值为〇。
(4)然后依次由A管用移液管加入5 mL、5 mL、10 mL、15 mLNaN〇3溶液(1
mol-L-1)，将溶液稀释，使溶液浓度分别为C2、G、〇、G，用同法测定每份溶 液流经毛细管的时间^、^、0、、5。应注意每次加入NaN〇3溶液后，要充分混合 均匀，并抽洗粘度计的E球和G球，使粘度计内溶液各处的浓度相等。
(5)溶剂流出时间的测定。用蒸馏水洗净粘度计，尤其要反复流洗粘度计的毛细 管部分。用1 mol.L-1NaN〇3洗1〜2次，然后由A管加入约15 mL1 mol.L-1NaN〇3 溶液。用同法测定溶剂流出的时间t。。
t
n t0
(2-3)
式中，t为溶液的流出时间，t0为纯溶剂的流出时间。所以通过溶剂和溶液 在毛细管中的流出时间，从(1-6)式求得"r，再由图1-1求得["]
n] = KM(2-4)
30 °C聚丙烯酰胺的K=37.3x10-6，a=0.66。由此求出粘均分子量M。
20
乌贝路德粘度计
外推法求[n]
图2-1乌氏粘度计测定原理
Fig. 2-1.Determination principles of Ubbelohde viscometer
2.1.2.4聚丙烯酰胺粘度的测定方法
a)运动粘度
运动粘度（kinetic viscosity，Vk)用乌氏粘度计测得。
Vk=Ct(2-5)
Vk,单位为mm2-s-1; C为粘度计常数，本实验为0.01036 mm2-s-2; t为流出时间。
具体操作步骤同分子量的测定。
b)动力粘度
旋转粘度计工作原理，由同轴的转子与外筒（可用内径不小于8.5 cm的烧 杯代替）共同组成测量流体粘度的传感系统，当转子以某一转速旋转时，因外筒 固定不动，流体受到剪切而产生粘滞力，此力作用于转子表面而使转子受到粘滞 力矩，从而使测量游丝偏转一相应角度，流体粘度越大，该粘滞力矩也越大，偏 转角也越大。检测此平衡力矩，便可测得该流体的动力粘度值。
仪器的平衡力矩由精密游丝提供，设在平衡力矩作用下转子产生角位移所需时间 为t，则被测流体动力粘度（dynamic viscosity，Vd)可由下式描述：
Vd=KXt(2-6)
式中：K为仪器系数，由游丝刚度，转子结构系数及转速所决定。
动力粘度用旋转粘度计（1号转子，30rmin-1)测得，单位为Pa-s。
21
2.1.3实验结果与讨论 2.1.3.1聚丙烯酰胺固含量的测定
由于聚丙烯酰胺极易吸收空气中的水分，为保证实验结果的准确度，需测定 聚丙烯酰胺样品中纯聚丙烯酰胺的含量。称取一系列不同质量的固体样品，测定 了不同质量固体中的聚丙烯酰胺的含量，如表2-1:
表2-1不同质量固体样品中的纯聚丙烯酰胺的含量 Table 2-1 The solid content of HPAM samples
原样的质量（g)0.10560.20170.49780.80441.026
烘干后的质量（g)0.10400.19660.48610.77990.9985
固体含量（％)98.5497.4797.6596.9597.32
平均含量（°%)97.59
实验测得聚丙烯酰胺固含量为97.59 °%
2.1.3.2聚丙烯酰胺水解度的测定
测定其水解度对了解聚丙烯酰胺溶液的性质尤为重要。本实验使用的滴定管 为1 mL微量滴定管，最小刻度0.01 mL
表2-2测定的聚丙烯酰胺的水解度值 Table 2-2 The hydrolyzation degree of HPAM
消耗盐酸体积0.300.300.31
水解度（°%)232324
平均值（°%)23.3
实验测得的聚丙烯酰胺的水解度为23.3 %。
2.1.3.3聚丙烯酰胺分子量的测定
原始溶液浓度为200 mg*L-1；恒温温度30.00 °C
22
3/fI0/&II
00.050.10. 15
浓度/mol-L-1
图 2 -2 nsp/C—C 及 lnnr/C—C 图
Fig.2-2 The value of nsp/C—C and ln^r/C—C
由上图可得["]=2.219。
由公式(2-6)计算得聚丙烯酰胺的粘均分子摩尔质量M=1.71x107 g.mol-1。 2.1.3.4聚丙烯酰胺粘度的测定
测定了不同浓度的聚丙烯酰胺的动力粘度和运动粘度。结果如表2-3
表2-3不同浓度的聚丙烯酰胺的动力粘度和运动粘度
Table 2-3 The dynamic viscosity and kinetic viscosity of HPAM
浓度（mg/L)100200300400500
动力粘度Vd (mPa_s)21426588102
流出时间（s)230.01381.54562.88745.27967.33
运动粘度Vk (mm2/s)2.383.955.847.7210.02
如表2-3所示测定聚丙烯酰胺的动力粘度和运动粘度的变化趋势是吻合的，聚丙烯酰胺降解菌的筛选及降解含聚丙烯酰胺污水的室内研究, 都随聚丙烯酰胺的浓度增大而增大。
2.2聚丙烯酰胺降解影响因素探讨
本文考察了在实验室条件下，外界因素（光照、温度、pH值、机械剪切、 无机盐等）对聚丙烯酰胺稳定性的影响。由于聚丙烯酰胺是高分子量的聚合物， 单一的评价指标很难对其降解进行准确评价，因此，本文采用多种评价指标（浓 度、动力粘度、运动粘度）对其降解进行较为全面的衡量。
23
2.2.1主要仪器与试剂
2.2.1.1聚丙烯酰胺样品及主要试剂 同 2.1.1。
2.2.1.2主要仪器及设备
江苏太仓市实验设备厂 成都仪器厂 上海申安医疗器械厂 Nicolet, USA 上海第三分析仪器厂 HANNA instrument, USA 北京仪器厂 成都仪器厂
长沙湘仪离心机仪器有限公司
DSHZ-300水浴恒温振荡器 HSS-1数字超级恒温水浴槽 LDZX-50FAS压力蒸汽灭菌锅 AVATER 360FT-IR型红外光谱仪 721型分光光度计 pH计
乌氏粘度计（内径0.58mm) NDJ-99旋转粘度计 TG16-WS台式高速离心机
2.2.2实验内容与方法 2.2.2.1聚丙烯酰胺浓度评价
聚丙烯酰胺的浓度测定采用油田常用的淀粉-碘化镉法（大港石油管理局企 业标准——聚合物驱油剂室内评价方法，Q/DG1170-88)。浓度直接表示为吸光 度（absorbance，A)。
淀粉-碘化镉方法的原理是利用聚丙烯酰胺与溴反应，生成N-溴代聚丙烯酰 胺，剩余的溴用甲酸纳来还原，而N-溴代聚丙烯酰胺发生水解，放出次溴酸，加 入淀粉-碘化镉溶液，次溴酸氧化碘离子成碘，而碘与碘离子以及淀粉生成络合 物显蓝色。其颜色的深浅与聚合物的浓度成正比，用分光光度计测定其吸光度， 便可知相应的聚合物的浓度。反应方程式如下所示[61]:
OO
+ HBr
(2-8)
II^ cII
R—C—NH2 +Br2 ► R—C —NHBr
CO2
(2-9)
Br2+ HCOONa ► NaBr + HBr +
24
O
O
R—C—NHBr +H2O —-R—C—NH2 + HBrO(2-10)
HBrO + 2I-+ H+—► I2 + Br- + H2O(2-11)
测定步骤如下：
(1)用去离子水准确配制500 mg.L-1的聚丙烯酰胺溶液1 L。
(2)将配制好的500 mg_L-1的聚丙烯酰胺溶液用蒸馏水分别配制成50、100、150、
200、250、300、350、400、450、500 mg-L-1 的聚合物溶液各 50 mL。
(3)加5 mL pH3.5的醋酸缓冲溶液于11个50 mL的比色管中（1个空白参比）。 ⑷加入1mL个浓度的聚合物溶液、25-30 mL蒸馏水。
(5)加入1 mL饱和溴水，反应15 min。
(6)加入5 mL甲酸钠，等溶液褪色后再上下摇动，反应5 min,至颜色完全褪
去。
(7)加入5 mL淀粉-碘化镉溶液，并加入蒸馏水至刻度，摇匀。
(8)显色18 min后，在分光光度计上以585 nm的波测定溶液的吸光度，用空 白样作参比。
2.2.2.2聚丙烯酰胺粘度评价 评价方法同2.1.2.4。
2.2.3实验结果及讨论
2.2.3.1聚丙烯酰胺自然降解
将300 mg.L-1的聚丙烯酰胺溶液在避光放置，测定其浓度、运动粘度、动力 粘度随时间的变化。
25
sre-_0I/-"s8-A-mmI^Q
3°ureqJ0sqY
—■—Absorbance —◄ — Kynamic viscosity —Kinetic viscosity
一-Xmu/^SS-A-P-3^
0.05.0
0510152025
Time/day
图2-3聚丙烯酰胺自然放置的变化 Fig.2-3 The nature change of HPAM
由图2-3可以看出在三周之内聚丙烯酰胺的运动粘度、动力粘度变化不大， 说明其粘度具有较大的稳定性。而其浓度下降较大，主要是由于其在溶液中酰胺 基水解造成测定浓度降低。而其粘度在前五天内有先升高后下降的趋势，主要原 因是聚丙烯酰胺由于其高的分子量在溶液中不能立即溶解完全，还有一个相应的 溶胀期，三天左右溶解完全。
2.2.3.2温度的影响
将300 mg.L-1聚丙烯酰胺溶液在4、20、30、40、50和70 °C水浴环境避光
放置下，过4天、11天后测定各指标。
26
0.6-
•^d'OI/^-sou-A-mml^0 8lmqJ0sqy
■5
0-
■4
0-
3
0-
■2
0-
—Absorbance(after 11 days)
—A— Dynamic viscosity(after 4 days) —A— Dynamic viscosity(after 11 days)
—Kinetic viscosity(after 4 days)
—Kinetic viscosity(after 11 days)
i1 i• i1 i• i• i• i' i~
010203040506070
Temperature/°C
'-•O,mm/Aj-00S--H>-PS^
5 0 5 0 5
5-5-4-4-3-
图2-4温度对聚丙烯酰胺的影响 Fig.2-4 The effect of temperature on stability of HPAM 由图2-4可以看出聚丙烯酰胺在较低温度时，具有较高的热稳定性。即使在 70 °C温度下放置11天，其动力粘度只下降了 14 %，运动粘度下降了 12%，吸 光度（即浓度）下降了 14.5%。而在高温下，则会降解明显。300 mg.L-1聚丙烯 酰胺溶液在121 C高温维持1个小时，其动力粘度由0.065 Pa_s降低为0.052 Pa-s， 下降了 20 %。；运动粘度由5.80 mm2.s-1降低为4.66 mm2.s-1，下降了 20%。，吸光度 由0.538下降为0.405下降了 25 %。
2.2.3.3pH值的影响
配制300 mg-L-1的聚丙烯酰胺溶液，用1 mol-L-1的盐酸和1 mol-L-1NaoH溶液
调节其pH值由3-10变化，在此过程中测定其粘度与浓度的变化。实验结果如图 2-5所示：
27
—Absorbence
图2-5 pH值对聚丙烯酰胺的影响 Fig. 2-5 The effect of pH on stability of HPAM
由图2-5可以看出pH值对聚丙烯酰胺粘度的影响很大。300 mg.L-1聚丙烯酰 胺溶液的初始pH值为7.0-7.2。当将溶液pH值调向酸性时其粘度迅速降低，当pH 值为3时其动力粘度由0.065 Pa-s降低为0.011 Pa-s，下降了 83 °%；运动粘度由 5.83 mm2-s-1降低为1.17 mm2-s-1，下降了 80°%。其原因是H+使酰胺基质子化，使
聚合物的羧基离子的电斥力受到抑制，分子线团发生卷曲，表观尺度减小，从而 使粘度降低[57]。当pH值调向碱性时，其粘度基本无变化，主要原因是虽然碱性 可促进酰胺基水解，但对主链影响不大，所以对粘度影响不大。在酸性时对聚丙 烯酰胺浓度无影响，在碱性时由于酰胺基水解使测得的浓度有所降低。
由于测定的聚丙烯酰胺动力粘度与运动粘度的变化一致，以下实验均以测定 其动力粘度代表其粘度的变化。
2.2.3.4光照的影响
配制两组标准系列（浓度为100、200、300、400和500 mg.L-1)。一组暴露
在自然光下，一组放在阴暗处避光。经过11天、21天的放置，用淀粉一碘化镉 法测定其吸光度（图2-6a)。再配制两组150 mg_L-1和300 mg_L-1的聚丙烯酰胺溶 液，一组光照，一组避光。经过一定时间后，测其动力粘度变化（图2-6b)
28
ssqjosqv
-lighting(lldays)
°-1I1I1I1I1I
100200300 i400500
Concentratlon/mg-L
a)光照对浓度的影响/The effct of light on concentration of HPAM
b)光照对粘度的影响The effct of light on viscosity of HPAM 图2-6光照对聚丙烯酰胺的影响 Fig. 2-6 The effct of light on stability of HPAM 由图2-6a、图2-6b光照组与不光照组对比可以看出，光照组与不光照组相 对粘度随时间有很大变化，而相对浓度没有明显变化。HPAM的光致降解可以用 键能的大小来解释：HPAM中C-C、C-H、C-N键的键能分别为340、420和414 kJ-mol-1，因此相应地要断裂这些键所对应的波长分别为325、250和288 nm。 但由于臭氧层的存在,吸收了 286-300 nm的全部辐射，因此太阳辐射只能使C-C 键断裂，而对C-H和C-N键影响很小。这与Smith等[62]的研究结果一致。
29
2.2.3.5机械剪切的影响
配制了几组同一浓度系列的聚丙烯酰胺溶液，考察了普通过滤、滤膜减压过 滤、离心、振荡器剪切对聚丙烯酰胺的影响，测定了其浓度、动力粘度的变化。 普通过滤使用定性滤纸；滤膜减压过滤使用的滤膜为0.45 pm；离心机设定条件 为：转速9000 r.min-1，离心20 min;振荡器剪切设定的条件为：转速120 rmin-1, 室温下摇动3天。测定结果如图2-7.
-■— Original sample,Vd -★— Filtration,Vd —▲— Vacuum filtration，Vd -▼— Centrifugation,Vd
—□— Original sample,A —☆— Filtration,A —么一Vacuum filtration, A —▽— Centrifugation,A —〇— Shaker-shear,A
100
200
300
400
1.1
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.20-.
0.18¬
0.16¬
0.14¬
0.12¬
0.10¬
0.08
0.06
0.04
0.02
0.00
500
Concentration / mgL
图2-7机械剪切对聚丙烯酰胺的影响 Fig. 2-7 The effect of mechanical shear on stability of HPAM
由图2-7可以看出短时间的机械剪切（除滤膜减压过滤外）对聚丙烯酰胺的 浓度与粘度影响均不大，而长时间的振荡器剪切对其浓度和粘度都有较大影响， 且影响随着聚丙烯酰胺溶液的浓度增大而增大。滤膜减压过滤对其粘度有较大影 响，原因可能是在透过滤膜时，由于滤膜孔径很小（0.45 pm)，将聚丙烯酰胺的 长分子链剪切使其变为较短的分子链，粘度大幅度下降；由于酰胺基基本不受影 响，所以在此过程中聚丙烯酰胺的浓度变化不大。
2.2.3.6无机盐的影响
考察了阳离子对聚丙烯酰胺粘度和浓度的影响。一价离子以Na+为代表，二 价离子以Mg2+为代表，三价离子以Al3+为代表。实验结果表明少量的Al3+便可使 聚丙烯酰胺变成凝胶乃至沉淀。下图中列出的仅为Na+、Mg2+以及二者共同添
30
加（WNaCl:WMgC12=l:l)时对聚丙烯酰胺的影响。
图2-8矿化度对聚丙烯酰胺的影响 Fig. 2-8 The effect of minerlization on stability of HPAM
1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 ,
Xfl
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
由图2-8可以看出加入一价、二价阳离子都会使聚合物大分子线团收缩，溶 液粘度降低，二价离子比一价离子下降的更多。Na盐、Mg盐的混合盐所引起的 粘度比单独使用等量的Mg盐下降的更大一些，这是由于离子协同作用所致[63]。 由金属离子和羧基的缔合作用，使得聚合物大分子链收缩成线团，所以开始时加 入少量的金属离子就可使聚合物的粘度降低很多。当金属离子加入一定浓度以 后，继续投加时，粘度降低速度逐渐平稳，主要是因为金属离子已经不能进入分 子线团内，而是在分子线团外围凝结，并且由于线团之间的相互作用，使得彼此 的分子尺寸略有变小，粘度减小比开始时缓慢[63]。但无机盐对于聚丙烯酰胺的 浓度影响不大。
2.3评价方法优化
在对聚丙烯酰胺的理化性质和降解影响因素考察的基础上，根据现有的对聚 丙烯酰胺体系的评价方法，优化出在生物降解体系中适用的评价方法。
31
2.3.1主要仪器与试剂 同 2.1.1
2.3.2实验内容与方法 同 2.2.2
2.3.3实验结果及讨论 2.3.3.1聚丙烯酰胺的评价方法
依据聚丙烯酰胺的高分子量及其水溶液的高粘度的特点，对其的评价方法主 要是从粘度、浓度、分子量三方面去评价。三种评价方法中，由于聚丙烯酰胺的 粘度受到的影响因素很多（详见2.2聚丙烯酰胺降解影响因素探讨)，在本论文 中的对生物降解的评价中，特别是培养基中无机离子的存在使其粘度降低很大； 而用聚丙烯酰胺分子量的评价是建立在粘度基础上的粘均分子量，同样受到的影 响因素很多；而浓度的评价方法受到环境的影响因素较少，所以本实验中以浓度 评价聚丙烯酰胺降解为主，粘度和分子量评价为辅。
2.3.3.2聚丙烯酰胺浓度测定方法
聚丙烯酰胺浓度的测定方法有很多，聚丙烯酰胺降解菌的筛选及降解含聚丙烯酰胺污水的室内研究,文献中使用的方法有淀粉-碘化镉法、 浊度法、荧光分光光度法、高效分子排阻色谱法、凝胶色谱法、放射性同位素标 记法、有机碳含量法、量热法、UV/可见光光谱法、沉淀法等[64]。其中最常用、 简单快捷、重现性好的方法是淀粉-碘化镉法和浊度法。
本实验采用淀粉-碘化镉法测定聚丙烯酰胺的浓度。浊度法的原理是聚丙烯 酰胺在酸性条件下与次氯酸钠发生霍夫曼重排反应，生成不溶于水的胺类化合 物，其浊度值与聚丙烯酰胺浓度成正比[65]。由于本实验主要考察聚丙烯酰胺的 生物降解，培养基在培养一段时间之后，由于微生物的生长代谢培养基本身就有 很大的浊度。且浊度法使用的氧化剂——次氯酸钠浓度较大（13.1 g.L-1，15 mL)， 反应时间较长（30 min)，副反应较多，所以会影响测定结果的准确性。而淀粉 碘化镉法在一定程度上可以避免，其反应时间较短（15 min)，用量较少（3.0%， 1mL)，且多余的溴水会被甲酸钠还原，最大限度地减少了副反应。
2.3.3.3淀粉-碘化镉法测定条件的优化
32
现有的文献中对于淀粉-碘化镉法的研究较多，并有较为成熟的测定条件。 但是对于其测定的醋酸缓冲溶液的最佳pH值却存在争议。大港油田管理局企业 标准（Q/DG1170-88)中缓冲溶液的最佳pH值为3.5，而关淑霞[66]等研究表明缓 冲溶液的最佳pH值为5.0。为确定缓冲溶液的最佳pH值，本论文测定了在缓冲 溶液的pH值为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5的条件下用淀粉碘化镉法测定了 0-500mg.L-1—系列不同浓度聚丙烯酰胺的吸光度值（图2-9)。
图2-9不同pH值醋酸缓冲溶液条件下测得的聚丙烯酰胺浓度标准曲线 Fig. 2-9 The concertration standard line of HPAM under different pH value of suffer
solution conditions
实验结果表明醋酸缓冲溶液pH为3.5时，测得的聚丙烯酰胺标准曲线线性最 好，其相关系数R2=0.9964，y=0.00154x+0.02557。
由图2-9还可以看出随着醋酸缓冲溶液pH值的增大，用淀粉-碘化镉法测得 的同一浓度的聚丙烯酰胺溶液的吸光度逐渐降低。这是由于氧化剂次溴酸在pH 增大的条件下越来越不稳定存在，影响了对聚丙烯酰胺酰胺基的氧化，所以测得 的吸光度逐渐降低。但是缓冲溶液的pH值降低在增大次溴酸的稳定性的同时也 使氧化的副反应增多，所以缓冲溶液的pH值也不能太低，本实验选择醋酸缓冲 溶液最佳pH为3.5。
33
2.4本章小结
1)对本论文所用的聚丙烯酰胺的理化性质进行了测定。聚丙烯酰胺的固含 量为97.59 %，水解度为23.3 %，粘均分子量为1.71X107。
2)对聚丙烯酰胺降解影响因素进行了探讨。pH值、光照和矿化度对聚丙 烯酰胺的粘度影响较大，而对于聚丙烯酰胺的浓度影响较小。低温和弱的机械剪 切对聚丙烯酰胺的粘度和浓度影响都不大，而高温和强的机械剪切对聚丙烯酰胺 的粘度和浓度影响都比较大。
3)对聚丙烯酰胺的评价方法进行了优化，以浓度评价聚丙烯酰胺降解为主， 粘度和分子量评价为辅；在浓度评价方法中采用淀粉-碘化镉法，并对其测定条 件中的缓冲溶液的pH值进行了优化，测定的缓冲溶液的最佳pH值为3.5。
34
3聚丙烯酰胺降解菌的筛选及性能评价
3.1菌株的筛选及鉴定
3.1.1实验材料与仪器
3.1.1.1菌种来源
菌种来自胜利油田采出水。
3.1.1.2主要试剂
溶菌酶，：Fluka 62970，北京欣经科生物技术有限公司
蛋白酶K，Roche 109126，北京欣经科生物技术有限公司
RNaseA，Merck，北京欣经科生物技术有限公司
三（羟甲基）胺基甲烷（Tris)，分析纯，国药集团化学试剂有限公司
十六烷基三甲基溴化胺（CTAB)，分析纯，天津科密欧化学试剂开发中心
十二烷基硫酸钠（SDS)，分析纯，天津科密欧化学试剂开发中心
聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP)，SigmaP-6755分装，北京欣经科生物技术有限
公司
Tris 饱和酚，H&YBio.Co.Ltd，Tianjin，China.
溴化乙锭（EB)、TAKARA上样缓冲液，ABI，USA TAKARA 2500DNA 分子量标准，ABI，USA
其它试剂：氯化钠、乙酸钠、EDTA、氯仿、异戊醇、异丙醇、乙醇等，均 为分析纯。
3.1.1.3主要仪器及设备
江苏太仓市实验设备厂 上海山连实验设备有限公司 北京亚泰科隆实验科技开发中心 上海申安医疗器械厂 上海第三分析仪器厂 HANNA instrument, USA
35
DSHZ-300水浴恒温振荡器 SHP-150生化培养箱 YT-CJ-IND净化工作台 LDZX-50FAS压力蒸汽灭菌锅 721型分光光度计 pH计
TGL-16G台式高速离心机上海医用分析仪器厂
Eppendorf 微量移液器Germany
3.1.1.4培养基
选择性液体培养基（g.L-1):聚丙烯酰胺0.3，酵母浸粉0.05, KH2PO4 1.0， MgS〇4.7H2〇 0.2，NaCl 0.5，pH值 7.0。
选择性固体培养基：向上述培养基中加入15〜20g/L的琼脂粉，制成平板。 富集培养基（g-L-1):牛肉浸膏3.0，蛋白胨10.0, NaCl 5。
3.1.2实验方法
3.1.2.1菌种的筛选
分别取油田采出水接种到装有选择性液体培养基的锥形瓶中，放入温度为 37 °C、转速为140rmin-1的恒温水浴振荡器中培养数天，然后在平板上划线，并 在37 °C的生化培养箱中培养。
选择生长良好的菌株作为实验菌株，扩大培养和驯化，然后借助形态学观察 和生理生化实验进行鉴定。
3.1.2.2菌种的常规的生理生化性质测定
本实验参照《简明第八版伯杰细菌鉴定手册》[68]、《常见细菌系统鉴定手册》 [69]对筛选的细菌进行生理生化性质测定，将细菌初步鉴定到属。鉴定方法主要 有革兰氏染色法、芽孢染色法、V-P实验、葡萄糖氧化发酵实验、淀粉水解试验、 甲基红试验、接触酶试验、明胶液化、半固体琼脂穿刺、细菌的运动性观察、硫 化氢反应等。
(1)革兰氏染色：挑取少量菌苔涂布在载玻片上，风干，在火焰上固定涂 片，滴加结晶紫染色1-2 min，水洗，滴加碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1 min， 水洗。用滤纸吸去载玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用95 %的乙 醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。用番红液复染约2 min，水洗。 干燥后，用油镜观察。菌体被染成蓝紫色的为革兰氏阳性菌，被染成红色的为革 兰氏阴性菌。
(2) 芽孢染色：加1-2滴水于小试管中，用接种环挑取2-3环菌苔于试管 中，搅拌均匀，制成浓的菌悬液。加孔雀绿染液2-3滴于小试管中，并使其与菌
36
液混合均匀，然后将试管置于沸水浴的烧杯中，加热染色15-20 min。用接种环 挑取试管底部菌液数环于洁净载玻片上，涂成薄膜，然后将涂片通过火焰3次温 热固定。水洗，直至流出的水无绿色为止。用番红染液染色2-3 min，倾去染液 并用滤纸吸干残液。干燥后用油镜观察。芽孢呈绿色，芽孢囊及营养体为红色。
(3)接触酶实验
将24 h培养的斜面接种，以玻璃棒沾取少许涂在3 %过氧化氢的玻片上，如 有气泡产生则为阳性，无气泡为阴性。
(4)甲基红实验
培养基：蛋白胨，5 g.L-1;葡萄糖，5 g.L-1; K2HPO4，5 g.L-1。在培养液中
加入一滴甲基红试剂，红色为甲基红试验阳性反应，黄色为阴性反应。
(5)V-P试验
培养基同甲基红试验。取培养液和40 %氢氧化钠等量相混。加少许肌酸， 10 min如培养液出现红色，即为试验阳性反应。
(6)淀粉水解
在肉汁胨中加0.2 %可溶性淀粉，制成平板。培养2-5天，形成明显菌落后， 在平板上滴加碘液平板呈蓝黑色，菌落周围如有不变色透明圈，表示淀粉水解阳 性，仍是蓝黑色为阴性。
(7)纤维素水解
培养基：蛋白胨，5 g.L-1; NaCl，5 g.L-1。将培养基分装试管，在培养基中
浸泡一条优质滤纸，能将滤纸条分解成一团纤维或将纸条折断或变薄者为阳性， 无变化者为阴性。
(8)明胶液化
培养基：蛋白胨，5 g.L-1;明胶，100-150 g.L-1。分装试管，取18-24 h的斜
面培养物穿刺接种，做空白，于20 °C温箱中培养，在20 °C以下的室温观察明胶 是否液化，如菌已生长，明胶表面无凹陷且为稳定的凝块，则为明胶水解阴性。 如明胶凝块部分或全部在20 C以下为可流动的液体，则为明胶水解阳性。 3.1.2.3基因组DNA的提取、纯化及测序
⑴细胞收集：取5 ml菌液在高速离心机上以9000 rmin-1速度离心10-15 min，
形成菌体细胞沉淀物，缓吸及清除上清液。
37
(2)裂解细胞:将离心所得菌体沉淀移入到2 mL缓冲溶液中(其组成为0.1 mol-L-1 磷酸盐、0.1 mol-L-1Tris、0.01mol-L-1 EDTA、1.0 mol-L-1 NaCl和 1.0 %CATB, pH值为8.0)，加入600 0的10 %SDS溶液和60 pl的蛋白酶K(20mg-ml-1 )，并
轻微混匀，直到细胞处于悬浮状态。然后将细胞的悬浮液在80 °C水浴中放 官30 min之后在室温冷却。
(3) RNase处理：在细胞裂解液中加入3 pL的RNase A,反复颠倒混匀溶液，在 3 7 C温度中放置30-60 min,以去除DNA样品中的RNA。
(4) 除蛋白：加入700 pL酚：氯仿：异戊醇(体积比为25: 24: 1)，混合均匀，
在12000 rmin-1下离心10 min,分离出上清液至新的离心管中。重复此步骤
3次。
(5)DNA抽提：在上一步所得的含有DNA的上清液中加入600 pl的纯异丙醇， 剧烈振荡混合溶液。用13000-16000 rmin-1速率离心10 min,倒掉上清液， 再加入70 %乙醇600 pL并充分混合，再用15000 rmin-1速率离心1 min，吸 出上清液，将离心管倒置于纸巾上凉干。用50pL缓冲溶液(10 mmol_L-1Tris， pH值为8.0)溶解沉淀物即为DNA粗提液，并置于-20 °C贮存。
(6)DNA纯化：使用北京天为时代生物技术公司的DNA纯化试剂盒，按照操作 说明进行DNA粗提液的纯化。
(7) 将纯化的DNA送至天根生化科技（北京）有限公司测序。
3.1.2.4系统发育树构建
将16S rDNA序列上传至美国基因数据库(GenBank)获得GenBank登记号，
与基因数据库比对，对获得的同源序列进行序列分析。用用ClustalW软件按照 最大同源性原则进行多重序列比对，将比对结果导入Mega 4.0软件邻位连接法 (Neighbour-Joining，NJ)和最大简约性法(Maximum Parsimony methods，MP)建
立条带序列系统进化树。
注：构建进化树的算法主要分为两类：独立兀素法(discrete character methods) 和距离依靠法(distance methods)。所谓独立元素法是指进化树的拓扑形状是由序 列上的每个碱基/氨基酸的状态决定的(例如：一个序列上可能包含很多的酶切位 点，而每个酶切位点的存在与否是由几个碱基的状态决定的，也就是说一个序列 碱基的状态决定着它的酶切位点状态，当多个序列进行进化树分析时，进化树的
38
拓扑形状也就由这些碱基的状态决定了 )。而距离依靠法是指进化树的拓扑形状 由两两序列的进化距离决定的，进化树枝条的长度代表着进化距离。独立元素法 包括最大简约性法(Maximum Parsimony methods)和最大可能性法(Maximum Likelihoodmethods)，距离依靠法包括除权配对法(UPGMAM)和邻位相连法 (Neighbor-joining)[69]。
3.1.3实验结果及讨论
3.1.3.1筛选结果
初步筛选到三株好氧的聚丙烯酰胺降解菌。分别命名为PM-2、PM-3、PM-4。
菌落照片 / The colony photo革兰氏染色照片/The Gram's stain photo
a) PM-2
菌落照片/ The colony photo革兰氏染色照片/The Gram's stain photo
b) PM-3
39
菌落照片 / The colony photo革兰氏染色照片/The Gram's stain photo
c)PM-3
图3-1菌株的菌落和革兰氏染色照片 Fig. 3-1 The colony and gram staining potos of the three strains
3.3.3.2菌株的生理生化性质
表3-1菌体的表面形态特征和生理生化特征
Table 3-1 Characterization of the strains
鉴定特征PM-2PM-3PM-4
菌落颜色白色淡黄色乳白色
是否透明不透明不透明半透明
菌落表面不光滑、干燥光滑、干燥光滑、湿润
菌落边缘形 态
菌体形态规则，有晕环 杆状规则，有晕 环
杆状规则，无晕 环
短杆状
革兰氏染色++-
芽孢染色++-
接触酶+--
甲基红试验+++
V-P试验+--
明胶液化+++
淀粉水解++-
纤维素水解++-
40
3.1.3.316S rDNA测序比对结果
下表为菌株测定的序列（已上传至GenBank获得登录号）与GenBank中已 有的序列比对结果，具体基因序列见附录2。
表3-2菌株的测序结果
The result of 16S rDNA sequence determination
菌株GenBank中与各菌株亲缘关系最近的前十个菌株
(GenBank登录号）|GenBank登录号| (相似性)
PM-2
(FJ598436)Baci//us cereus strain FM-4 |EU794727| (95%) Baci//us cereus strain NX9 |FJ390480| (95%) Baci//us sp. cp-h63 |EU584552| (95%) Baci//us sp. GUF8 |EU169574| (95%) Baci//us sp. cp-h71 |EU719665| (95%) Baci//us sp. cp-h35 |EU584539| (95%) Baci//us cereus strain IV17 |EU366379| (95%) Baci//us sp. By187(B)Ydz-hh |EU070379| (95%) Baci//us sp. cp-h36 |EU584540| (95%) Baci//us cereus strain W-2 |EU187485| (95%) Baci//us sp. M7-23 |EU706321| (95%) Baci//us sp. M7-20 |EU706318| (95%) Baci//us sp. M7-17 |EU706315| (95%) Baci//us sp. M7-14 |EU706312| (95%)
PM-3
(FJ598437)Baci//us sp. M7-11 |EU706309| (95%) Baci//us sp. M2-3 |EU706291| (95%) Baci//us cereus strain DC11 |EU048539| (95%) Baci//us sp. W-21 |AF390088| (95%) Bac^//-us cereus strain FM-4 |EU794727| (95%) Bac^//-us cereus strain FM-4 |EU719665| (95%) Ochrobactrum anthro^-i |AM490614| (94%) Ochrobactr^um anthrop-i |AM114410| (94%) Ochrobactr^um anthrop~i |AM114409| (94%) Uncultured Ochrobactrum sp. |AY851687| (94%)
PM-4
(FJ598438)Ochrobactr-um sp. Ca-34 |DQ647056| (94%) Ochrobactrum intermedium isolate ADV1 |AF526509| (94%) Ochrobactrum intermedium |AM490631| (93%) Ochrobactrum sp. ROi52 |EF219049| (93%) Uncultured bacterium clone RO238 |EF219037| (93%) Bacterium EAB-2EF12.08 |EU149209| (97%)
3.1.3.4菌株的系统发育树
经测序后获得1237bp的PM-2的16S rDNA序列，在GenBank中进行Blast, 挑选同源序列分值较高的有代表性菌株，以strain FM-4 (EU794727)为参比菌株，米用邻接法(neighbour-joining method, NJ)和最大简约
41
性法(maximum parsimony method, MP)将PM-2和前十个最相近的菌种的序列作
49
56
644
58
B. C. strain FM-4 (EU794727)
B. sp. cp-h71 (EU719665)
B. sp. cp-h63 (EU584552)
-B. sp. GUF8 (EU169574)
-B. sp. By187(B)Ydz-hh (EU070379) 641 B. C. strain W-2 (EU187485)
B. sp. cp-h35 (EU584539)
B. C. strain NX9 (FJ390480)
-B. sp. cp-h36 (EU584540)
B. C. strain IV17 (EU366379)
PM-2
系统发育树。（在图中将说〇7/妨缩写为B.，cerews缩写为C.)
0.01
图3-2基于PM-2菌株和相近的菌株16S rDNA构建的NJ系统发育树 Fig.3-2 Phylogenetic neighbour-joining tree based on the 16S rDNA genes from the PM-2 strain and their nearest neighbours retrieved from GenBank Databas
57PM-2
51
4
34
4
17
18
B. sp. cp-h36 (EU584540)
B. C. strain NX9 (FJ390480)
B. sp. cp-h35 (EU584539)
B. C. strain FM-4 (EU794727) B. sp. cp-h63 (EU584552)
B. sp. cp-h71 (EU719665)
B. C. strain IV17 (EU366379)
B. sp. By187(B)Ydz-hh (EU070379) B. sp. GUF8 (EU169574)
B. C. strain W-2 (EU187485)
图3-3基于PM-2菌株和相近的菌株16S rDNA构建的MP系统发育树
Fig.3-3 Phylogenetic maximum parsimony tree based on the 16S rDNA genes from the PM-2 strain and their nearest neighbours retrieved from GenBank Databas
由以上两种方法构建的系统发育树可以看出，PM-2与其他10株亲缘关系相 近的菌株的进化差别还是较大，与PM-2碱基差别最小的是cerews1 IV17。
经测序后获得1089bp的PM-3的16S rDNA序列，在GenBank中进行Blast，
挑选同源序列分值较高的有代表性菌株，以gac///ws sp. M7-23(EU706321)为
42
57
83
B. sp. M7-23 (EU706321)
B. sp. M7-11 (EU706309)
B. sp. M2-3 (EU706291)
B. sp. M7-17 (EU706315)
B. sp. M7-14 (EU706312)
B. sp. M7-20 (EU706318)
■ B. sp. W-21 (AF390088)
B. C. strain DC11 (EU048539)
100
^I B. C. strain NX9 (EU794727) 961巳.C. strain FM-4 (EU719665) PM-3
参比菌株，采用邻接法和最大简约性法将PM-3和前十个最相近的菌种的序列作 系统发育树。（在图中将说〇7/妨缩写为B.，cerews缩写为C.)
0.005
图3-4基于PM-3菌株和相近的菌株16S rDNA构建的NJ系统发育树 Fig. 3-4 Phylogenetic neighbour-joining tree based on the 16S rDNA genes from the PM-3 strain and their nearest neighbours retrieved from GenBank Databas
B. sp. M7-23 (EU706321) B. sp. M7-17 (EU706315) B. sp. M7-11 (EU706309) B. sp. M7-14 (EU706312) B. sp. M2-3 (EU706291) B. sp. M7-20 (EU706318)
9
4
6 ■
13
99
45
74, PM-3
B. C. strain DC11 (EU048539) 39■ B. sp. W-21 (AF390088)
B. C. strain NX9 (EU794727)
B. C. strain FM-4 (EU719665)
图3-5基于PM-3菌株和相近的菌株16S rDNA构建的MP系统发育树
Fig. 3-5 Phylogenetic maximum parsimony tree based on the 16S rDNA genes from the PM-3 strain and their nearest neighbours retrieved from GenBank Databas
由以上两种方法构建的系统发育树可以看出，PM-3也与其他10株亲缘关系 相近的菌株的进化差别较大，与PM-3碱基差别最小的是5««+//狀sp.W-21。
经测序后获得1100bp的PM-4的16S rDNA序列，在GenBank中进行Blast， 挑选同源序列分值较高的有代表性菌株，以5此+//狀sp. M7-23(EU706321)为
43
参比菌株，采用邻接法和最大简约性法将PM-4和前十个最相近的菌种的序列作 系统发育树。（在图中将厂―缩写为B.，intermedium缩写为I.，腫 缩写为O. Uncultured缩写为U.)
O.anthropi (AM114410)
O. sp. Ca-34 (DQ647056)
O. anthropi (AM114409)
O. I. isolate ADV1 (AF526509)
O. anthropi (AM490614)
L PM-4
B. EAB-2EF12.08 (EU149209)
O. I. (AM490631)
O. sp. ROi52 (EF219049)
U. B. clone RO238 (EF219037) U. O. sp. (AY851687)
0.1
图3-6基于PM-4菌株和相近的菌株16S rDNA构建的NJ系统发育树 Fig. 3-6 Phylogenetic neighbour-joining tree based on the 16S rDNA genes from the PM-4 strain and their nearest neighbours retrieved from GenBank Databas
99
57
77
8
3
2
O. sp. ROi52 (EF219049)
U. B. clone RO238 (EF219037)
U. O. sp. (AY851687)
O. I. (AM490631)
O. sp. Ca-34 (DQ647056)
PM-4
O.anthropi (AM114410)
O. I. isolate ADV1 (AF526509)
O. anthropi (AM490614)
7 1O. anthropi (AM114409)
B. EAB-2EF12.08 (EU149209)
图3-7基于PM-4菌株和相近的菌株16S rDNA构建的MP系统发育树 Fig. 3-7 Phylogenetic maximum parsimony tree based on the 16S rDNA genes from the PM-4 strain and their nearest neighbours retrieved from GenBank Databas
由以上两种方法构建的系统发育树可以看出PM-4与tfcAro&ctru? sp Ca-34有很近的亲缘关系。
以PM-2为参比菌株，采用邻接法将PM-2、PM-3、PM-4三株菌的序列作
44
系统发育树。
-PM-2 PM-3 -PM-4
0.05
图3-8基于PM-2、PM-3和PM-4的16S rDNA构建的NJ系统发育树 Fig. 3-8 Phylogenetic neighbour-joining tree based on the 16S rDNA genes from the PM-2 PM-3 and PM-4 strains 表3-3三株菌的Tajima测试结果 Table 3-3 Results from the Tajima test for 3 Sequences.
ConfigurationCount
Identical sites in all three sequences (mm)723
Divergent sites in all three sequences 扣谀）15
Unique differences in Sequence A (mijj)28
Unique differences in Sequence B (miji)25
Unique differences in Sequence C (miij)245
Note: The equality of evolutionary rate between PM-2(A) and PM-3(B) is tested using PM-4(C) as an outgroup in Tajima' relative rate test in MEGA4. The % test statistic was 0.17 (P = 0.68028 with 1 degree[s] of freedom). P-value less than 0.05 is often used to reject the null hypothesis of equal rates between lineages.
由图3-8和表3-3可以看出PM-2和PM-3具有较近的亲缘关系，而PM-4
与二者的亲缘关系较远。
3.1.3.5鉴定结果
结合生理生化性质和16S rDNA比对结果可以判断：PM-2为蜡样芽胞杆菌， PM-3为枯草芽孢杆菌，PM-4为苍白杆菌。
3.2菌株的降解性能评价
3.2.1实验材料与仪器
3.2.1.1主要仪器及设备
DSHZ-300水浴恒温振荡器江苏太仓市实验设备厂
45
上海山连实验设备有限公司 北京亚泰科隆实验科技开发中心 上海申安医疗器械厂 上海第三分析仪器厂 HANNA instrument, USA
SHP-150生化培养箱 YT-CJ-IND净化工作台 LDZX-50FAS压力蒸汽灭菌锅
721型分光光度计 pH计
3.2.1.2培养基
选择性液体培养基（mg.L-1):聚丙烯酰胺0.3，酵母浸粉0.05, NaN〇3 0.2，， KH2PO4 1.0，MgS〇4.7H2〇 0.2，NaCl 0.5，pH值 7.0。
选择性固体培养基：向上述培养基中加入15〜20g/L的琼脂粉，制成平板。 富集培养基（mg-L-1):牛肉浸膏3.0，蛋白胨10.0, NaCl 5。
3.2.2实验内容与方法 3.2.2.1菌种降解性能评价
采用油田常用的淀粉一碘化镉方法测定聚丙烯酰胺的含量。生物降解率祝％) 的表达式为：
n=(CQ-C1)/CQX 100%(式 3-1)
式中：C0表示降解前的聚丙烯酰胺含量(mg_L-1); C1表示降解后的聚丙烯酰 胺含量(mg.L-1)。
3.2.2.2生长曲线的测定
将菌种以相同的接种量接入富集培养基（或选择性液体培养基）中，37°C， 140 r/min培养，每隔一定时间测定培养液的OD600 (或OD470)值，以OD600 (或 OD470)值代表细菌的生物量。富集培养基和选择性液体培养基在波长为600、 470nm处有各自最大池度值。 3.2.3实验结果及讨论 3.2.3.1细菌的降解组合优化
由于胜利油田采出水中聚丙烯酰胺的含量约为300 mg.L-1，所以选择性培养 基中聚丙烯酰胺的浓度为300 mg.L-1。在300 mg.L-1HPAM培养基将三株菌进行 组合培养后(按等量原则接种，见表3-3)，最终优化出PM-2与PM-3的混合菌降
46
解效果最好(图3-9)。
&PM-4
表3-3组合培养时菌株的接种量 Table 3-3 Inoculum size of combined cultivation
组合■接种量（mL)
PM-2PM-3PM-4
300
单株菌030
003
1.51.50
两株菌1.501.5
01.51.5
三株菌111
图3-9菌株组合培养对聚丙烯酰胺的降解率 Fig. 3-9 Degradation rate of single bacterium and the mixed
三株菌共同混合的降解效果并不最优，这可能是由于三株菌之间存在拮抗作 用。由图3-9可以看出，PM-4可能与其他两株菌存在拮抗作用。组合培养含有 PM-4的菌株，降解效果都不如单株菌的效果。而PM-2、PM-3的组合表现协同 效应，其降解效果优于单株菌的降解效果，降解率可达42 %。这可能是由于 PM-2和PM-3具有较近的亲缘关系，而与PM-4的亲缘关系较远（详见3.1.3.4 菌株的系统发育树)。
3.2.3.2细菌的生长及pH值的变化
测定微生物的生长曲线对于了解微生物的生长特性是十分必要的。分别测定
47
PM-2、PM-3和两者混合在富集培养基（图3-10)和选择性培养基（图3-11)中 的生长曲线。混合菌的生长曲线，在富集培养基中与PM-2的生长曲线类似，说 明在富集培养基中，PM-2为优势种群，而在选择性培养基中，在生长前期与PM-2 的生长曲线类似，而生长后期与PM-3类似，说明在含有PAM的选择性培养集 中，在生长前期PM-2为优势种群，而后PM-3的贡献开始逐渐增加，在生长后 期PM-3为优势种群。
图3-10菌株在富集培养基中的生长曲线 Fig. 3-10 Growth curve of single bacterium and the mixed in enriched medium
图3-11菌株在选择性培养基中的生长曲线 Fig. 3-11 Growth curve of single bacterium and the mixed in selective medium
48
图3-12在选择性培养集中菌株生长过程中pH变化 Fig. 3-12 pH change in vegetation process of single bacterium and the mixed in selective medium
为探究混合菌在选择性培养基生长的更多特性，在测定生长曲线的同时，还 测定了 PM-2、PM-3和二者的混合在选择性培养基生长过程中的pH变化。由图 3-12可以看出，在生长过程中，pH值先降低后增大。pH的降低，可能是培养基 中酵母浸粉被细菌利用而产生酸性物质使pH值降低。在生长后期，酵母浸粉被 利用完，产生的酸性物质也被细菌利用转化为中性物质而使pH值又有所回升。 PM-2与PM-3混合中，在生长前段时期，即前十五个小时，溶液的pH值变化， 由PM-2控制，随后，PM-3对pH值的贡献开始增大，这与混合菌生长曲线的测 定结果相一致。
3.3混合菌降解条件优化
3.3.1实验材料与仪器
实验材料与仪器同3.2.1 3.3.2实验内容与方法 3.3.2.1菌种降解聚丙烯酰胺的性能评价
采用油田常用的淀粉一碘化镉方法测定聚丙烯酰胺的含量，详见3.2.2.1。 3.3.2.2菌种降解原油的性能评价
49
采用中华人民共和国石油天然气行业标准：油田污水中石油类含量测定方法 —分光光度法（SY/T 0530-93)。
3.3.3实验结果及讨论
3.3.3.1混合菌生源条件优化
由于聚丙烯酰胺属于难降解的高分子有机物，需向其溶液中添加营养元素以 促进聚丙烯酰胺的降解。
1)碳源的选择
实验用碳源为葡萄糖、蔗糖、液体石蜡、原油。四种碳源分别以质量分数为 0.2 g.L-1的用量分别加入基础培养基。PM-2与PM-3混合菌在40°C培养3天后， 测定降解率。如图3所示。
图3-13不同碳源对降解率的影响 Fig. 3-13 The effect of carbon sources on HPAM degradation
由图3-13可以看出，加石蜡一组的降解效果最好，加原油的效果次之。加 入葡萄糖和蔗糖的降解效果不如石蜡和原油，原因可能是加入好利用的碳源葡萄 糖和蔗糖后，对聚丙烯酰胺的利用下降。考虑到本实验最终目的是将混合菌应用 到实际油田采出水中，处理实际条件下的油田废水中聚丙烯酰胺，故选用原油作 为碳源。但在活化细菌时使用石蜡作为碳源。
以原油为碳源，考察了降解菌对不同浓度的原油的降解情况。首先测定了原 油浓度随吸光度变化的标准曲线。结果如图3-14。相关系数R2=0.9994，曲线方
50
程为 y=0.01258x-0.03018。
图3-14原油浓度的标准曲线 Fig.3-14 The standard line of crude oil concentration
在40°C培养3天后测定了细菌对原油的降解率（图3-15)。由图中可以看出 随着原油浓度的增加，原油降解率呈下降趋势。当原油浓度为50 mg_L-1时降解 率为73.1 %，而原油浓度增大为500 mg-L-1时，降解率下降为15.4 %。一般产出 水中原油为200-300 mg.L-1，在此范围内降解菌降解率在25%-40 %之间。
图3-15降解菌对不同浓度的原油的降解率 Fig.3-15 The degradation rate of crude oil by the strains
51
2)氮源的选择
实验用外加氮源选择为NH4CI、NaN〇3、（NH4)2S〇4、NH4NO3、蛋白胨。五
种氮源分别以0.2 g.L-1的用量分别加入基础培养基。40°C培养3天后，测定降解 率（图4)。
图3-16氮源对降解率的影响
Fig. 3-16 The effect of nitrogen sources on HPAM degradation
由图3-16可以看出，加入氮源后降解率都不如不加氮源的降解效果好。这 可能是细菌在基础培养基中生长代谢，利用聚丙烯酰胺的胺基作为氮源，从而降 解聚丙烯酰胺，而加入好利用的氮源以后，细菌优先利用其他氮源，而利用聚丙 烯酰胺中胺基的效率下降，从而导致聚丙烯酰胺的降解率下降，这也与 Kay-Shoemake等[70]的研究结果相一致。但在实验中，以原油为碳源时仍需加入 少量外加氮源以提高对原油的降解率。由上图可以看出NaNO3对降解的影响比较 小，选择NaNO3为附加氮源。
3)磷源的选择
实验用的磷源只考察了KH2PO4、K2HPO4及KH2PO4-K2HPO4缓冲体系磷源， 同时以未加磷源的培养基作为对比。KH2PO4、K2HPO4及KH2PO4-K2HPO4 (roKH2PO4:roK2HPO4=1:1)都以1g/L的用量加入培养基。在相冋条件下培养3天， 测定聚丙烯酰胺降解率（图3-17)。
52
5-
0
Non-P
K2HPO4KH2PO4 K2HPO4&
KH2PO4
图3-17不同磷源对聚丙烯酰胺降解率的影响 Fig. 3-17 The effect of phosphorus source on HPAM degradation
由测定结果可以看出，没有磷源的一组聚丙烯酰胺的降解率远远低于含有磷 源的三组。这可能是细菌在降解聚丙烯酰胺的过程需要消耗大量的ATP (三磷酸 腺苷）和活性酶，因此需要充足的磷源来补充消耗。而KH2PO4-K2HPO4缓冲体 系磷源的一组比KH2PO4和K2HPO4的单一磷源降解率高，这可能是 KH2PO4-K2HPO4组成的缓冲体系使溶液的pH值稳定，有利于细菌的生长与代谢。
考察了KH2PO4-K2HPO4 (WKH2PO4:WK2HPO4=1:1 )的用量对微生物降解聚丙烯 酰胺的影响（图3-18)。当KH2PO4-K2HPO4的用量为1 g.L-1时其降解率就达到 稳定值，此时磷源已足以满足降解的需要，所以选择KH2PO4-K2HPO4的用量为1 g-L"1。
53
_ _ I _ I _ I _ I
0 5 0 5 0 4 3 3 2 2
% / 3SJ UOI^PSSSQ
0.00.20.40.60.81.01.21.41.6
Concentration of phosphorus source / gL 1
图3-18磷源浓度对降解率的影响
Fig. 3-18 The effect of phosphorus source concentration on HPAM degradation
3.3.3.2混合菌生长条件优化
1)降解时间的影响
Fig. 3-19 The change of degrading rate and the pH in vegetation process of the mixed bacteria
测定了 PM-2、PM-3混合菌在选择性培养基生长过程中对HPAM降解率的 变化。由图3-19可以看出，混合菌对聚丙烯酰胺的降解主要是在前3天内，在 之后的时间里，降解率基本稳定。所以本实验把第3天作为降解实验的终止。在 混合菌降解过程中，pH值略有所降低，一方面聚丙烯酰胺水解产生羧基，另一 方面细菌新陈代谢过程中可能产生酸性物质。
图3-19降解率和pH值随时间的变化曲线
54
2)活化次数的影响
取经过不同连续活化次数的相同菌浓的试验用混合菌菌液，按照同样比例接 种到300mg/L的HPAM中，37°C恒温培养3天后，测定PM-2、PM-3混合菌
对HPAM溶液降解率的变化（图3-20)。
图3-20活化次数对降解率的影响 Fig. 3-20 Degrading rates under different times of activation
结果表明随活化次数的增加聚丙烯酰胺的降解程度逐渐增大。在HPAM的 生物降解过程中，微生物都有适应新的营养来源的能力。细菌与HPAM接触后 并不会立即进行分解反应，而是要经过一段时间的诱导适应，当通过活化而使细 菌经历了诱导适应过程后再重新与HPAM溶液接触，就会大大缩短诱导时间， 使细菌降解能力得到提高。测定在选择性培养基中生长曲线时，混合菌已被活化 5次，所以在生长过程中基本没有延滞期。结合测定结果与实际的实验条件连续 活化次数选择为4次。
3)接种量的影响
将PM-2、PM-3混合菌向培养基中分别按不同的体积分数接种。在同等条件 下培养3天后测定。
55
0 5 0 5 0 1 3 2 2 1 1
% / 9SJ uolspsg9Q
iIIIiIIII
012345678 Amount of inoculation / %(volume fraction)
图3-21接种量对降解率的影响
Fig. 3-21 the degrading rate under different amount of inoculation
从图3-21可以看出，混合菌初始接种量对聚丙烯酰胺溶液的降解率影响较 大，HPAM溶液的降解率随接种量的增加而增大。当接种体积分数为3%时，聚 丙烯酰胺溶液降解率达到稳定值，但当接种量增加到一定程度，溶液的降解率不 再有明显的增加，甚至有所下降。这可能是由于接种量增加而造成混合菌生长空 间及营养供应不足，使混合菌的生长繁殖、代谢受到抑制，因此选择初始接种体 积为3 %。
4)培养温度的影响
分别设定了不同的生长温度，在同等条件下静置培养一周。测定不同温度下 PM-2、PM-3混合菌对300 mg.L-1 HPAM溶液的降解效果。聚丙烯酰胺溶液的降
解率进行了测定，从而确定了降解实验的最佳温度。由于是静止培养，供氧明显 不足，细菌生长缓慢，降解率皆偏低。由图3-22可以看出，细菌对聚丙烯酰胺 溶液降解程度较高的温度范围是35 °C-45 °C。温度高于50 °C对降解实验会产生 极大的影响，聚丙烯酰胺的降解率低于2 %。
56
图3-22温度对降解率的影响 Fig. 3-22 the degrading rate under different temperature
5)初始pH值的影响
图3-23 pH值对降解率的影响 Fig.3-23 Degrading rate under different pH
配制300mg/L的聚丙烯酰胺培养基，考察了初始pH值为5.0〜9.0范围内 PM-2、PM-3混合菌对聚丙烯酰胺的降解情况。结果见图3-23。实验结果表明， 初始pH值的不同对聚丙烯酰胺溶液中的细菌产生了一定的影响。本实验中筛选 到的聚丙烯酰胺降解菌，最适pH值范围是6.0-7.5。过高或过低的pH值都不利 于聚丙烯酰胺的降解。
6)氧含量的影响
57
在摇瓶试验中，含氧量的直接控制和测定都比较困难，通常利用改变摇床转 速的方式调节含氧量，提高转速是提高液体培养基氧含量的重要手段，转速对菌 株的生长和聚丙烯酰胺的降解的影响如图3-24。结果表明，该菌株是好氧菌， 随着供氧量的增加，生物量也迅速增加。考虑摇床转速的限制，通常选择的摇床 培养转速为140 rmin-1。
图3-24摇床转速对聚丙烯酰胺降解的影响 Fig. 3-24 Degrading rate under different shaker rotate speeds
7)矿化度的影响
试验结果表明，细菌生长和对聚丙烯酰胺的降解活动对矿化度有一定的要 求，矿化度过低、过高均不利于菌种对聚丙烯酰胺的降解。如图3-25所示，矿化 度在25000-10000 mg.L-1之间时对聚丙烯酰胺的降解效果较好，高于10000 mg-L-1 有明显变化。矿化度的影响与菌种的生理特性密切相关，在矿化度为2500-10000 mg*L-1的条件下，外界提供细菌生长所需的条件，对聚丙烯酰胺的降解效果最好， 矿化度增加，细胞脱水，当矿化度达到一定程度时导致细菌的死亡，降解效果变 差。
% / 9SJ uol^p亡Jg9°
5 0 5
02500 5000 7500 10000 12500 15000
Minerlization content/mg-L"1
图3-25矿化度对聚丙烯酰胺降解率的影响 Fig. 3-25 Degrading rate under different minerlization content
3.4本章小结
1)初步筛选到三株好氧的聚丙烯酰胺降解菌种，分别命名为PM-2、PM-3、PM-4。 通过生理生化性质和16S rDNA鉴定，PM-2为蜡样芽胞杆菌，PM-3为枯草芽孢 杆菌，PM-4为苍白杆菌。
2)将三株菌进行混合正交培养后，优化出PM-2与PM-3的混合菌降解效果最好， 300 mg.L-1聚丙烯酰胺溶液的降解率最高可达到42 %。
3)优化了混合菌降解条件，选择原油为碳源，KH2PO4-K2HPO4缓冲体系为磷源， NaN〇3为辅助氮源。最佳降解时间为3天，连续活化次数为4次，接种体积分数 为3 %，温度为35°C-45 °C，初始pH值为6.0-7.5,摇床转速为140 r-min"1，矿化 度为 2500 "10000 mg-L"1。
4聚丙烯酰胺降解机理的初探
聚丙烯酰胺的降解通常分为氧化降解、生物降解、机械降解和热降解等类型 [7]。近年来,人们对HPAM降解机理的研究主要集中在两个方面：化学降解和生物 降解。
4.1HPAM的化学降解机理研究进展
HPAM的化学降解又可分为氧化降解、光降解和光催化降解[7]。
4.1.1HPAM的氧化降解反应机理
HPAM的氧化降解反应机理是自由基反应机理。
朱麟勇等[71-73]研究了 HPAM的氧化降解反应机理。研究认为HPAM的氧化降 解包括两个主要过程：（1)自动氧化过程；（2)连锁裂解过程。在氧化降解过程中 首先由于商品聚丙烯酰胺(以P-H表示)带有的过氧化物杂质(以POOH表示)分解 产生初级自由基，引发连锁自动氧化反应，当升温或微量还原性物质存在时，这 种自动氧化反应显著加速。促进聚合物链自由基(P•和PO0的产生（图1)。
图4-1 HPAM的氧化降解反应机理
Fig. 4-1 The mechanism of HPAM5s oxidative degradation
引发的连锁氧化反应可表示为式(4-1)〜式(4-4)，
POOH ^ PO*+*OH
60
P-H+.〇H^P-+H20 P«+02 ^POO* POO-^POOH +P.
(4-2)
(4-3)
(4-4)
随后，聚合物链上的自由基引发a-裂解反应和p-裂解反应，使主链断裂(式 (5)〜式(8)),
(4-6)
(4-5)
(4-7)
(4-8)
a-
在缺氧条件下，链自由基发生分子链间偶合反应，生成一定交联结构。
裂解反应和p-裂解反应引起聚合物断裂，使聚合物分子量迅速下降，同时伴随发 生脱酰胺或脱羧反应，产生不同氧化降解产物，值得指出，这种氧化降解的连锁 反应具有较大的动力学链长，因此微量氧足以引起溶液粘度的大幅度降低。在缺 氧条件下，链自由基发生分子链间偶合反应，生成一定交联结构。詹亚力等[7,74] 在研究聚丙烯酰胺氧化降解时做出类似推断。
张铁锴等[27]研究了 Fenton试剂氧化降解聚丙烯酰胺的机理。在其建立的机理 模型中，压〇2在Fe(II)存在下生成-OH，同时体系中生成的[Fe(III)(H〇2)]2+又可 再生Fe(II)。这个模型也包括.HO2AO2-和.OH的传递反应以及终止反应。其机理 可表示如下：
链的引发
(4-9)
(4-10)
(4-11)
(4-12)
(4-13)
(4-14)
(4-15)
(4-16)
(4-17)
Fe2++H2〇2+OIT+.OH
Fe3++H202 ^[Fe(m)(H02)f++H-
[Fe(m)(H02)]2+^Fe2++H02
.〇H+H2〇2 ^H〇2-+H2〇
链的传递 链的中止
P-H +*0H ^Inorganic
Fe2++*OH ^Fe3+ + OH_
Fe2+ +-0H ^Fe3+ + OH-
+HC^.^Fe2++C^ t +1^
H〇2*+H〇2*—^H2〇2 + 〇2 个
王宝辉等[28]对高铁酸钾氧化去除油田污水中聚丙烯酰胺进行了研究。对高 铁酸钾氧化HPAM反应机理进行推断如下：
FeO2"+H++ (CH2—CH2)^CONH2 —(CH2—CH2)^CONH2+FeO4.—
CH2 = CH2—CONH2+CH2 = CH2 —COOH +HFeO4- — CO2 个 +H2O + Fe3+ +NO3 +N2 个
(4-18)
其过程首先是HPAM断链，变成更小的HPAM分子，这一步反应很快，继 而氧化成单体和丙烯酸等，最后生成无机物。由此而使HPAM降解和降粘。
在制备K2FeSO4纯品时产生大量的滤液中含有饱和K2FeSO4和大量未反应的 KClO,具有强氧化性，是很好的氧化剂。陈颖等[29, 75]研究了高铁酸钾滤液对油 田三元复合驱模拟污水的降解。降解机理如下：
4K2FeO4 + 10H2O ^ 4Fe(OH)3 + 3O2 + 8KOH(4-19)
(4-20)
O•可直接氧化HPAM或与HPAM作用，发生链式反应，最后生成小分子的 聚丙烯酰胺直至完全矿化。
(HPAM“ --[O^U(HPAM)m + (HPAM)„ - O(4-21)
(HPAM)OT [O] > mAM(4-22)
AM [O]^ CO2 T + H2O + N2 T +OH- + CO2-(4-23)
HPAM + ClO> CO2 T+ H2O + N2 T+ C〇2-(4-24)
在碱性条件下K2FeO4与聚合物反应时，聚合物中氢过氧化物主要是在N原子 a位的亚甲基上形成，但该氢过氧化物由于笼蔽效应并不引发新的氧化链，过氧 化物均裂生成的羟基自由基与烷氧自由基重新反应生成酰亚胺和水。根据双分子 分解机理，可直接得到酮和水，最终产生的仍是酰亚胺和水，含CIO-的滤液继续 氧化中间产物，最终生成CO2和H2O等小分子化合物。高铁酸钾滤液具有更好的氧 化效果，这是因为存在C1O-和FeO42-的协同作用所致。
4.1.2HPAM的光降解机理
已有的研究表明：自然光和紫外线照射可以直接使HPAM降解。
Smith等[62]用不同的天然水源配制HPAM溶液，置于用塑料膜封口的玻璃瓶 中，日光经过瓶口照射溶液，观察6周时间内溶液中AAM、NH4+和pH的变化。 结果发现，一段时间后溶液中单体AAM显著增长，NH4+下降，微生物浓度未见 明显改变。这说明HPAM链在环境条件下发生了分裂，但单体不会明显变化，且 降解的主要原因是光致裂解，而非生物降解。研究认为HPAM的光致降解可以用 键能的大小来解释：HPAM中C-C，C-H，C-N键的键能分别为340 , 420和414 kJ-mol-1，因此相应地要断裂这些键所对应的波长分别为325、250和288 nm。 但由于臭氧层的存在，吸收了 286-300 nm的全部辐射，因此太阳辐射只能使C-C 键断裂，而对C-H和C-N键影响很小。
在实验室条件下，罗一菁等[76]在有紫外灯光照射存在的情况下，聚丙烯酰 胺能发生单纯的光解反应。经过80 min的照射，聚丙烯酰胺的浓度降为起始浓度 的50 %左右。陈颖等[77]研究紫外光降解情况也得出相同的结论。
4.1.3HPAM的光催化降解机理
大量的研究表明，光催化法对环境污染物有很好的去除效果，反应过程中产 生强氧化性基团(主要是_OH)，通过自由基使很多生物难降解的物质最终可以达 到完全矿化。特别是对传统的化学方法难以除去的低浓度污染物，光催化效果更 显著[77]。
雒维国等[78]考察了暗箱、50 W自然光源、25 W紫外灯、125 W中压汞灯环 境下的对催化1102降解聚丙烯酰胺的情况。结果表明：暗箱中PAM水溶液光催 化效果最差，中压汞灯的效果最好，因为在光催化降解过程中，光源所发出的所 有光中起作用的是紫外或接近紫外部分的光，波长小于385 nm的紫外光可以实 现Ti〇2的光催化，同时光的强度越大，能量利用率越高，中压汞灯光强度很大， 光反应的活化能来源于光子能量，可以将光子看作反应物，而自然光光源光谱在 短波部分的辐射强度最弱，发出的紫外光能量低，因此暗箱和自然光对该反应基 本无促进作用。光反应的活化能来源于光子能量，可以视光子为反应物，因此， 光源的能量分布及光强度大小对反应速度都有明显的影响。
罗一菁等[76]、陈颖等[77]也对光催化降解聚丙烯酰胺的情况进行研究，得出 相同的结论。
4.2HPAM的生物降解机理研究进展
生物降解是指有机物在生物酶的作用下，经过一系列的生物化学反应转化为 简单化合物的现象，有时可完全转化为无机物[79]。聚合物的生物降解是指在生 物作用下，聚合物发生降解、同化的过程。许多微生物并不是天生就具有降解聚 合物的能力，而是通过驯化而逐渐适应的，即催化降解聚合物的酶系是通过驯化 而诱导出的。起降解作用的微生物主要包括细菌、真菌和藻类，作用机理主要可 分归三类：（1)生物物理作用；由于生物细胞增长而使聚合物组分水解、电离或 质子化而发生机械性破坏，分裂成低聚物碎片；（2)生物化学作用；微生物对聚 合物作用而产生新物质(CH4, CO2和H2O); (3)酶直接作用；被微生物侵蚀部分
64
导致聚合物链的断裂或链的氧化。生物降解并非单一机理，是复杂的生物物理、 生物化学协同作用，并同时伴有相互促进的物理、化学过程[79-80]，如图4-2所示:
生物物理作用^
简单化合物 如：CH4、 C〇2、H2O、
有机酸等
分裂成低聚物碎片(HPAM)„、（HPAM)m
微生物生物化学作作用协同作用&
()n+m生长代谢|低聚物碎片分解成更简单化合物—'
酶的催化氧化
^C-C、C-N键断裂，酰胺基被氧化为羧基:V
图4-2 HPAM生物降解机理
Fig. 4-2 The biodegradation mechanism of HPAM
4.2.1生物降解机理的国外进展
国外研究者一般认为HPAM只能在细胞外酰胺酶的作用下作为氨源被微生 物利用，而作为碳源利用非常困难；但也有研究者认为可以作为碳源利用；有人 认为聚丙烯酰胺因为具有与氨基酸相近似的结构而被微生物所代谢[81]；近年来， 国外研究者发现水解聚丙烯酰胺的降解产物可作为细菌生命活动的营养物质，反 过来营养的消耗又会促进HPAM的降解[32]；但研究者有一个共识：聚丙烯酰胺具 有强的生物抗性，属于难降解的有机物。
Suzuki等[32]发现聚丙烯酰胺和聚丙烯酸盐只在好氧的条件下被微生物轻微 地降解，实验中使用的体积排阻色谱和总有机碳测定分析方法。实验发现只有在 高浓度的情况下有轻微降解，甚至是被臭氧氧化后的小分子（分子量从280,000 降解到840)也具有极强的生物抗性。认为聚丙烯酰胺的生物抗性不仅与其高的 分子量有关还与其特殊的碳链骨架有关。
Mourato和Gehr[82]研究表明丙烯酰胺/二烯丙基二甲基氯化铵的共聚物在 混合好氧培养基中没有被降解，但是丙烯酰胺/丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵的共 聚物有一定的氧气消耗，这部分氧气的量比聚丙烯酰胺全部降解的需求量少，所 以是部分降解。研究还表明无论是在丙烯酰胺/二烯丙基二甲基氯化铵的共聚物 还是丙烯酰胺/丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵的共聚物存在的条件下都没有影响 葡萄糖的降解。
Soponkanaporn和Gehr[83]通过体积排阻色谱法检测到微生物对丙烯酰胺/
65
丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵的好氧降解。研究结果表明聚丙烯酰胺可作为碳源被 降解为C〇2。
Schumann and Kunst [84]用14C标记的阴离子的聚丙烯酰胺和阳离子的聚丙烯 酰胺在活性污泥中降解作用。研究表明两种聚合物都没有被显著降解(小于2%)。 在厌氧环境中也得到类似的结论，没有任何一种有显著的厌氧降解。
Grula等[85]研究了厌氧菌一硫酸盐还原菌对聚丙烯酰胺的降解作用。研究 表明聚丙烯酰胺和部分水解聚丙烯酰胺可促进硫酸盐还原菌的生长。聚丙烯酸具 有一定程度的生物毒性，而阳离子的聚合物对硫酸盐还原菌降解具有很强的抗 性。Schumann and Kunst (1991)研究表明这部分的碳表现了聚丙烯酰胺碳骨架 的生物抗性。Grula等也研究了土壤中好氧细菌对聚丙烯酰胺的降解情况，包括 了阴离子的、非离子的和阳离子的聚丙烯酰胺。非离子的和阴离子的聚丙烯酰胺 可作为唯一氮源促进假单胞属的几个种的细菌的生长。氮源来自于聚丙烯酰胺产 生的丙烯酰胺产生中酰胺基的水解。酰胺基的水解是通过假单胞菌产生的酰胺水 解酶进行的。而聚丙烯酰胺的碳骨架[-CH2-]不能被降解。阳离子的聚丙烯酰胺 在任何条件下也不能被微生物利用，对生物具有极高的毒性。
Kunichika N[48]等在30°C下从活性污泥和土壤中分离出能以水溶性聚丙烯酰 胺为唯一碳源和氮源的 Enterobacter agglomerans 和 Azomonasm acrocytogenes 两株 好氧降解菌株。实验表明，微生物只能利用聚丙烯酰胺中的一部分，而不能利用 其中的酰胺部分，即使是低浓度的聚丙烯酰胺也不能全部被利用。
Larson等[86]报道了活性污泥中微生物对聚丙烯酸的寡聚物和聚合物的降解 情况。研究表明丙烯酸单体和二聚体可以被完全降解为二氧化碳。丙烯酸的寡聚 物（一直到七聚体）可以被部分降解。对于更高分子量的聚合体（1000-4500) 降解能力下降很多，分子量超过1〇6就不可被降解。
8说匕6^3〇4等[42]对白腐真菌降解聚丙烯酰胺进行研究发现：白腐真菌只在限 氮的条件下对聚丙烯酰胺的有显著降解，且降解速度比在氮充足的条件下快两倍 多。这表明白腐真菌是把聚丙烯酰胺作为氮源利用，进而对其降解。
Kay-Shoemake等[70 ,87]研究证实在聚丙烯酰胺存在下土壤中好氧微生物会 产生酰胺水解酶，并可以将聚丙烯酰胺作为唯一氮源促进土壤中好氧微生物的生 长。聚丙烯酰胺先被转化为长链聚丙烯酸酯，而后者可以被微生物作为氮源利用。
66
但是聚丙烯酰胺（PAM)的主碳链骨架不能被微生物利用，而且聚丙烯酸（PAA) 也不能作为碳源被利用。研究者还报道了被机械剪切或紫外降解后的小分子的聚 合物（分子量为3000-4000)也同样不能作为碳源利用。
Sojka等[88]研究了聚丙烯酰胺在土壤中的应用对微生物的影响。研究发现使 用聚丙烯酰胺的土壤中的细菌、真菌的总量要比没有聚丙烯酰胺的土壤中的要 少。聚丙烯酰胺的应用可以潜在地控制致病菌在水土中的转移传播。
Chang等[89]考察了在好氧环境和厌氧环境微生物对丙烯酰胺/丙烯酰氧乙基 三甲基氯化铵共聚物的降解情况，好氧环境采用耗氧量评价，厌氧环境采用气体 产生量评价。研究表明聚合物在好氧和厌氧环境中都可以被微生物部分降解。但 都只是阳离子的那部分被降解，主碳链没有受影响。
El-Mamouni等[39]利用光降解和生物降解联用来降解大分子量的聚丙烯酰 胺。利用紫外光降解提高聚丙烯酰胺的可生化性。即使紫外光降解破坏了聚丙烯 酰胺的大分子结构，微生物也很难全部利用聚丙烯酰胺。考察了紫外光降解后好 氧菌和厌氧菌对聚丙烯酰胺的降解情况。结果表明好氧降解比厌氧降解对聚丙烯 酰胺的利用度高。
Haveroen等[3]研究了在厌氧条件下聚丙烯酰胺（一种絮凝剂）对微生物的产 甲烷作用的促进机制。研究表明，聚丙烯酰胺可作为唯一氮源促进微生物的生长 和提高甲烧的产生量。
Hollimana等[5]研究了交联聚丙烯酰胺凝胶在土壤中的降解情况，考察了化 学、物理、生物降解对聚丙烯酰胺的影响。研究表明交联聚丙烯酰胺凝胶对微生 物降解具有很强的抗性，在土壤中微生物群落产生的酰胺酶的作用下，发生非常 缓慢降解。Sojka等[90]研究了在一段长时间（6月、7月、8月三个月）内聚丙烯 酰胺对土壤中微生物的群落的影响。虽然聚丙烯酰胺在土壤中的应用在某些情况 下会减少细菌和真菌的总量，但对于微生物潜在的新陈代谢没有很大影响。 Caesar-TonThat[91]等研究了在有聚丙烯酰胺存在的土壤中微生物群落的情况。研 究表明向土壤中添加聚丙烯酰胺促进了一些特殊的真菌（担子菌）和细菌的生存 和生长。
67
4.2.2生物降解机理国内进展
由于聚合物驱在油田的大范围使用以及含聚污水的逐年增加，国内研究者对 于含聚丙烯酰胺污水的处理研究逐渐增多。而国内对聚丙烯酰胺的降解研究也基 本集中在对采油用的阴离子型部分水解聚丙烯酰胺（HPAM)开展的，相对于国 外对机理的研究有更深入的探讨。
有研究者认为HPAM能作为唯一的碳营养源被硫酸盐还原菌所代谢。黄峰等 (2002) [35]的研究结果表明：硫酸盐还原菌不仅能以HPAM为碳源生长繁殖，而 且还能使HPAM降解导致其溶液粘度损失，可降低HPAM驱油效率。程林波等[24] 研究硫酸盐还原菌（SRB)降解聚丙烯酰胺表明：硫酸盐还原菌以HPAM作为碳 源，以S〇42-作为最终电子受体进行生长、繁殖，对HPAM进行分解代谢，从而起 到降解HPAM的作用。
李宜强等（2007) [49]提出了微生物的好氧降解聚丙烯酰胺的机理。研究表 明微生物体内的脱氨酶在还原性酶的辅助作用下，首先断开HPAM中的C-N键， 解离出NH2-离子，而该NH2-原来的位置被OH-所取代，生成-COOH;同时，在〇2 的参与下，微生物酶首先进攻的位点是碳链的末端甲基，在单加氧酶的作用下， 碳链末端甲基首先被氧化成醇，进而被氧化成羧酸，且羧基的第二个氧原子是从 H2O中引入的。如果a-碳原子上取代有1个甲基，这时P-氧化的结果只产生丙酰 COA而不是乙酰COA。如果在P-碳原子上取代有其它基团或在同一碳原子上取代 有2个甲基后在碳链末端碳原子上取代有3个基团，那么就会抗P-氧化，因为P- 氧化要求P-原子上没有取代基。但是在微生物中存在有a-氧化（即从碳链上移去 1个碳原子），这样就可以避免P-原子上存在取代基而无法被微生物分解的情况。 经过一系列有各种微生物酶参与的氧化反应，长链的HPAM就被断裂成短链及可 被微生物吸收的小分子有机物。这些有机物以及从HPAM中解离出来的NH2-提供 了微生物新陈代谢所必不可少的碳源和氮源。用于合成蛋白质和其它含氮、含碳 有机物质。整个降解HPAM的过程需要消耗大量的ATP (三磷酸腺苷）能量(627.83 J-mol-1)和还原性辅酶，所以要提供足够的磷源。
68
CC
II
C——CTTC——C-pC^rC——C COOH
t丨f个
f代表a-氧化的位点；#代表氧化的位点
图4-3 a-氧化和P-氧化作用位点的示意图 Fig. 4-3 The position of a-oxidation and P-oxidation
刘永建等[43]在实验的基础上推断了降解菌降解聚合物的生物机理。微生物 通过胞外蛋白水解一CONH2，使C一N键断裂时，通常会出现少量-CHO、-C-O 自由基等不稳定中间产物，它们大部分会在胞外蛋白作用下继续反应生成 -COOH。降解菌会在繁殖过程中产生一系列还原性代谢产物，它们能够同聚合 物中的氧化物发生自由基氧化还原反应；聚合物侧链上的不稳定中间体会受此攻 击，导致P碳原子和Y碳原子之间的C-C键断裂，使碳链变短。由于反应后基本未 出现新基团，所以C-C键断裂处主要是生成-CH3和-COOH等基团，形成新的稳定 形态（图4-2)。
Fig.4-4 The products of HPAM biodegradation
郝春雷等[50]研究了复合菌降解菌降解聚丙烯酰胺的不同作用。有的菌种主 要依靠所分泌的胞外蛋白降解聚合物，数种蛋白组成复杂的降解酶系，共同作用 于聚合物使之降解，而有的菌种则释放非蛋白类还原性物质作用于聚合物。
69
4.3HPAM生物降解的机理初探
4.3.1实验材料与仪器 4.3.1.1菌种来源
实验室分离的菌株PM-2和PM-3。 4.3.1.2主要仪器及设备
DSHZ-300水浴恒温振荡器江苏太仓市实验设备厂
SHP-150生化培养箱上海山连实验设备有限公司
YT-CJ-IND净化工作台北京亚泰科隆实验科技开发中心
LDZX-50FAS压力蒸汽灭菌锅上海申安医疗器械厂
AVATER 360FT-IR 型红外光谱仪 Nicolet, USA
721型分光光度计上海第三分析仪器厂
pH计HANNA instrument, USA
JSM-6700F扫描电子显微镜日本电子公司
LC-6AD高效液相色谱日本岛津
UV-2450紫外可见分光光度计日本岛津
HCT-1热分析仪北京恒久科学仪器厂
4.3.1.3培养基
富集培养基（g*L-1):牛肉浸膏，3.0;蛋白胨，10.0; NaCl，5; pH值7.0-7.2。 基础培养基（g.L-1):聚丙烯酰胺，0.3;酵母浸粉，0.1; KH2PO4，1.0; MgSO4.7H2O，0.2; NaCl，0.5; pH值 7.0-7.2。
固体斜面培养基：向基础培养基中加入15-20 g_L-1的琼脂粉，制成平板。
70
4.3.2实验内容与方法 4.3.2.1菌液制备和培养
将保存于4 °C冰箱中固体斜面培养基的2株菌取出，在无菌操作条件下，将 2株细菌接种于富集培养基，在40 °C恒温摇床(转速140 rmin-1)活化富集1天。 活化后的菌株在无菌条件下，用无菌注射器吸取一定量的菌液接入100 mL灭菌 后的基础液培养基中，于40 C恒温摇床(转速140 r_min-1)中培养3天后，用无 菌注射器吸取混合菌菌液再转接入新的100 mL灭菌后的基础液培养基，培养3 天，如此再重复转接两次，作为种子培养基。实验时，将种子培养基以一定量接 入实验培养基中。
4.3.2.2菌种降解性能评价
采用油田常用的淀粉一碘化镉方法测定聚丙烯酰胺的含量，详见3.2.2.1。 4.3.2.3仪器条件
液相色谱条件Shim- pack Vp-ODS(150x4.6 mm)色谱柱，流动相为甲醇:水 =1:1，流速为0.5 mL-min-1，进样量为25卟，柱温为30 C，柱压为5.1 MPa，检 测波长为260 nm。
4.3.3结果与讨论
4.3.3.1聚丙烯酰胺作为营养源的探讨
分别配制如下培养基。一组培养基为：在基础培养基的基础上添加NaN〇3 (0.2 g.L-1)，去掉酵母浸粉，以聚丙烯酰胺作为唯一碳源；一组培养基为：在基 础培养基的基础上添加石蜡（0.5 g.L-1)，去掉酵母浸粉以聚丙烯酰胺作为唯一氮 源；一组培养基为：在基础培养基的基础上去掉酵母浸粉以聚丙烯酰胺作为唯一 碳氮和氮源。每组都做空白，平行三样。40C恒温摇床(转速140 rmin-1)中培养7 天后考察聚丙烯酰胺作为唯一碳源、唯一氮源和唯一碳氮源情况下，微生物对聚 丙烯酰胺的利用情况。结果如图4-5所示：聚丙烯酰胺作为唯一氮源利用时降解
71
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
图4-5微生物对聚丙烯酰胺作为不同营养源的利用情况 Fig.4-5 Biodegradation under the condition that HPAM served as different nutrient sources
率最高。而聚丙烯酰胺作为唯一碳氮源利用时和作为唯一碳源利用时降解率相差 不大。这说明聚丙烯酰胺既可以作为碳源也可以作为氮源被微生物利用，但优先 被作为氮源利用。被作为氮源利用的部分是其酰胺基部分。
4.3.3.2降解前后聚丙烯酰胺的变化
1)生物降解前后的聚丙烯酰胺样品的扫描电镜图
聚丙烯酰胺水溶液和生物降解后的聚丙烯酰胺溶液脱水制得固体样品，用扫 描电镜扫描其结构变化，并与聚丙烯酰胺的固体样品作比较，如图4-6。聚丙烯 酰胺固体样品（图4-6a是一个大颗粒HPAM固体的表面，其表面吸附了许多小颗 粒的聚合物）和聚丙烯酰胺水溶液制得的固体样品（图4-6b)的表面十分致密， 几乎没有孔洞，而降解之后的聚丙烯酰胺固体（图4-6c)的表面支离破碎，而且 有许多孔洞。说明微生物的生长代谢使聚丙烯酰胺分子断裂为小的碎片、低聚物 或其他小分子有机物。
72
a)聚丙烯酰胺固体/HPAM Solid
b)生物降解前的样品 / Sample before biodegradation
c)生物降解后的样品 /Sample after biodegradation
图4-6聚丙烯酰胺样品的扫描电镜图
Fig. 4-6 The scanning electronic microscope photos of different HAPM samples
73
2)不同作用后聚丙烯酰胺的红外光谱图
利用红外光谱仪测定了不同作用后聚丙烯酰胺的红外光谱图，比较其结构变 化。图4-7a为聚丙烯酰胺固体、聚丙烯酰胺溶液（脱水后制得的固体样品）、高 温灭菌后聚丙烯酰胺溶液(脱水后制得的固体样品）的谱图，图4-7b是将300mg/L 的聚丙烯酰胺溶液高温灭菌后，一份做空白，一份用实验室保存的聚丙烯酰胺降 解菌PM-2和PM-3降解3天，将菌体离心和脱水后制得的聚丙烯酰胺样品和空 白中的聚丙烯酰胺（脱水后制得的固体样品）的对比图。
由图4-7a可以看出聚丙烯酰胺固体、聚丙烯酰胺溶液、高温灭菌后聚丙烯酰 胺溶液的红外谱图对比可以发现，后两个样品与聚丙烯酰胺固体的谱图最大的区 别在3100〜3500 cm-1区域和1500〜1700 cm-1区域，其主要原因是酰胺基不同程 度的水解造成吸收峰的不同，由于酰胺基进一步水解产生羧基，其C=O伸缩振 动产生的吸收峰与聚丙烯酰胺固体谱图中的吸收峰相比向高波数方向移动，由 1615 cm-1变为1668 cm-1和1670 cm-1。同样由于羧基中O-H的伸缩振动的影响， 在3100〜3500 cm-1区域，聚丙烯酰胺固体谱图中酰胺基的特征双尖峰3381 cm-1 和3273 cm-1在后两个样品中已不存在，而变成比较平滑的宽峰。但聚丙烯酰胺 固体谱图中1415 cm-1C-N伸缩振动峰和1475 cm-1N-H弯曲振动峰在后两个样品 依然存在，说明其酰胺基只是部分水解，并没有完全消失。由于后两个样品中含 有水分，在3600 cm-1及以上区域出现尖锐的水的O-H的伸缩振动吸收峰[92]。
由图4-7b可以看出生物降解后的聚丙烯酰胺谱图中C=O伸缩振动峰比降解 前向更高波数方向移动，1415 cm-1左右C-N伸缩振动峰和1475 cm-1左右N-H弯曲 振动峰已经消失，3100〜3500 cm-1区域成为一个宽大的吸收峰，这充分说明生物 降解后的样品中酰胺基已经被微生物降解完全变成了羧基。这与Kay-Shoemake 等[87]所研究的可作为氨源被微生物利用相一致。
74
8 0000000000 987654321
1 % / 30U-1I 目 USH
,HPAM Solid HPAM Solution HAPM Solution after Sterilizing
3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 Wave Number / cm"1
-Before biodegradation After biodegradation
00000000000
0987654321
0% / 8u^;ImsnmH
3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 Wave Nummber / cm-1
a)水解对聚丙烯酰胺的影响/ Effect of Hydroxylation on HPAM IR Spectra
b)生物降解对聚丙烯酰胺的影响/Effect of Biodegradation on HPAM IR Spectra
图4-7不同作用下聚丙烯酰胺红外光谱的变化 Fig. 4-7 The change of HPAM IR spectrum under different conditions
3)生物降解前后的聚丙烯酰胺样品的热力学变化
对降解前后的（脱水后制得的固体样品）样品做了差热曲线。测定条件：温 度范围为室温到600 °C，升温速率为5 °C/min。如图4-8。由降解前的差热曲线 可以看出聚丙烯酰胺在升温过程中在410 °C和555 °C发生了两次较大的变化。
75
变化标明两次降解，其中第一次降解过程主要为相邻酰 并形成酰亚胺的过程；第二次降解主要是脱氢、形成二 的聚丙烯酰胺的差热峰就显得比较平滑，主要原因可能 :变成了羧基，羧基的热稳定性要比酰胺基高，所以在升
30
oo/lv
Silva等[93]研究表明两次? 胺基之间相互缩合，脱氨 氧化碳的过程。而降解后 是降解后分子中的酰胺基 温过程中变化较小。
10¬
0-
0100200300400500600700
Temperature / °C
-Before degradation •After degradation
图4-8样品降解前后的差热分析曲线
Fig.4-8 The differential thermal analysis curve of HPAM samples before and after biodegradation
4)生物降解前后聚丙烯酰胺样品的紫外谱图
测定了降解前聚丙烯酰胺溶液的紫外谱图如图4-9。原聚丙烯酰胺溶液在紫 外波段236nm和197nm有吸收峰，这是酰胺基共轭体系和羧基共轭体系产生的紫 外吸收，而生物降解后，236nm处的吸收峰消失，说明聚丙烯酰胺的酰胺基降解 后转化为羧基。
76
30uraqjsqv
adation
ation
200220240260280
Wavelength / nm
图4-9样品降解前后的紫外谱图 Fig.4-9 The UV spectrums of HPAM samples before and a
5)生物降解前后聚丙烯酰胺的液相色谱图
用液相色谱检测了降解前后聚丙烯酰胺溶液的主要组
300
fter biodegradation
分的变化。为考察降解 相色谱图（图4-10)。 时间为 2.43 min、 4.08 、 4.08min 出现吸收峰 保留时间为 4.38 min 酰胺单体。
16000
14000
12000
310000
8000
4
3
6000
4000
2000
0
4.08
2.43
Before Biodegrad • After Biodegradat
ation
ion
,4.68
2.854.08
后是否存在丙烯酰胺单体，同时测定了丙烯酰胺样品的液 聚丙烯酰胺原溶液在此色谱条件下有三个峰出现，其保留 min、4.68 min。降解后的样品溶液在保留时间为2.43 min 外，在2.85min处出现一个较大的吸收峰。丙烯酰胺单体在 降解后样品在此处无吸收峰，所以降解后样品中不含丙烯
14
024681012
Time / min
matograms of HAPM
a生物降解前后聚丙烯酰胺溶液的液相谱图/Liquid Chro before and after Biodegradation
77
6 8 10 12 Time / min
160004.38
14000
12000
10000
8000¬
6000
4000¬
2000
02.85 4.08
_IlL
HPAM after Biodegradation ——Acrylamide Monomer
b生物降解后聚丙烯酰胺溶液与丙烯酰胺的液相谱图/Liquid Chromatograms of HAPM after Biodegradation and Acrylamide Monomer Formation 图4-10生物降解前后聚丙烯酰胺的液相色谱图 Fig.4-10 The liquid chromatograms of HPAM samples and acrylamide monomer
4.3.3.3生物降解机理的初探
聚丙烯酰胺作为一种稳定的高分子聚合材料，具有极强的生物抗性，即使是 已被降解为小分子的聚丙烯酰胺依然具有这一特征[32]。微生物分解聚合物一般 是微生物在菌体外分泌出聚合物的分解酶，分解酶再将高分子链分解成低分子链 或使其侧基脱落。酶对高分子链的攻击普遍在链端进行，即以内切的方式进行 [33]。由于细菌一般是带有负电荷，而油田用的聚丙烯酰胺为阴离子型聚丙烯酰 胺，由于产生静电排斥，细菌很难直接接近接近聚丙烯酰胺分子链，而是通过分 泌出胞外的酰胺水解酶去进攻处于侧链的酰胺基。酰胺水解酶已被研究证实存在
于红球菌、芽孢杆菌、分支杆菌、产碱杆菌、假单胞菌、短杆菌等很多细菌中[87]。 降解过程如图4-11所示：
78
辅酶
C—C—C—C-
ATP
加单氧酶
小分O 〇2
子有辅酶r 11
十C C C C七
机物◄OH I
ATPCOOH
O2COOH COOH
辅酶 ATP
OH
辅酶
COOH COOH
ATP
图4-11聚丙烯酰胺的生物降解机理 Fig 4-11 The progress of HPAM degradation by the bacteria
首先，在微生物分泌的酰胺水解酶和还原性辅酶作用下，HPAM中酰胺基 的C-N键被断开，解离出NH2-离子，而该NH2-原来的位置被OH-所取代，生成 -COOH；同时，在O2的参与下，在加单氧酶的作用下进攻a位的碳原子发生a-氧 化，原来处于a位的碳原子被氧化为醇，醇进一步被氧化为醛，最后被氧化为羧 基，在此过程中，末端的碳（羧基）被移去。经过这样一系列有各种微生物酶参 与的氧化反应，长链的HPAM就被断裂成短链、可被微生物吸收的小分子有机物。 这些有机物以及从HPAM中解离出来的NH2-提供了微生物新陈代谢所必不可少 的碳源和氮源。整个降解HPAM的过程需要消耗大量的ATP和还原性辅酶，所以 要提供足够的磷源[49’58]。
4. 4本章小结
在总结前人对聚丙烯酰胺降解机理研究的基础上，探讨了细菌对聚丙烯酰胺 的利用情况，结果表明聚丙烯酰胺既可以作为氮源利用也可以作为碳源利用，通 过扫描电镜、红外分析、差热分析、紫外分析以及液相分析等手段对生物降解前 后的样品的表征的基础上对微生物好氧降解聚丙烯酰胺的机理进行了初探。在其 分泌的胞外酰胺酶的作用下聚丙烯酰胺先被作为氮源利用，在其生长和代谢过程 中，聚丙烯酰胺被断裂为小分子有机物，又可以作为碳源被细菌利用。
79
5室内模拟实验
在优化的实验条件基础上进行了室内模拟实验研究。室内模拟实验采用生物 接触氧化法。
根据污水生物处理法的原理和工艺的不同，污水生物处理可分为[94_96]:污水 生物处理可分活性污泥法、生物接触氧化法、生物转盘法、生物流化床法、生物 氧化塘、膜生物反应器法等。
生物接触氧化法具有BOD容积负荷高，污泥生物量大、处理时间短、能够 克服污泥膨胀问题、可以间歇运转、维护管理方便等优点成为油田污水处理的有 效方法[97]。生物接触氧化法是使微生物附着在载体表面上，污水在流经载体表 面过程中，通过有机营养物的吸附、氧向生物膜内部的扩散以及在膜中所发生的 生物氧化等作用，对污染物进行分解[98]。
5 1含聚污水的水质分析及可生化性调整
为进行污水的生物降解实验，首先对污水进行水质分析，在对水质分析的基 础上对污水进行可生化性调整。
5.1.1实验材料与仪器
5.1.1.1主要实验材料
菌株PM-2和PM-3、胜利油田采出水、自制生化池、溶氧氧测定管、微孔 滤膜（0.45 pm)、膜填料。
5.1.1.2主要实验仪器
美国哈希公司 北京艾诺威商贸有限公司 日本尼康公司 日本岛津
DI2500 COD快速测定仪 ET9924A BOD 测定仪 YS100显微镜 UV-2450型紫外分光光度计
80
保定兰格恒流泵有限公司 广东日生集团有限公司 玉环求精医用仪器厂 上海山连实验设备有限公司 北京亚泰科隆实验科技开发中心 上海申安医疗器械厂
BT300-1J蠕动泵 ACO-003曝气泵 XB-K-25血球计数板 SHP-150生化培养箱 YT-CJ-IND净化工作台 LDZX-50FAS压力蒸汽灭菌锅
5.1.2实验内容与方法
5.1.2.1水质分析标准及测试方法
(1)含油量测定
引用中华人民共和国石油天然气行业标准[99]:油田污水中石油类含量测定 方法一分光光度法（SY/T 0530-93)。
方法：石油醚萃取水中的石油类物质，利用紫外分光光度计在430 nm波长 下测定石油醚溶液的吸光度，通过标准曲线计算得到水中的含油量。
(2)悬浮固体含量测定（SS)
引用中华人民共和国国家标准[100]:水中悬浮固体的测定一重量法 (GB11901-89)。
方法：将水通过0.45 pm的滤膜，截留在滤膜上并在103-105 °C烘干后得到 的固体物质，通过称量，计算得到水样中悬浮固体的含量。
(3)总氮的测定（TN)
引用中华人民共和国国家标准[101]:水质总氮的测定一碱性过硫酸钾消解紫 外分光光度法（GB11894-89)。
在60 C以上水溶液中，过硫酸钾可分解产生硫酸氢钾和原子态氧，硫酸氢 钾在溶液中离解而产生氢离子，故在氢氧化钠的碱性介质中可促使分解过程趋于 完全。分解出的原子态氧在120-124 C条件下，可使水样中含氮化合物的氮元素 转化为硝酸盐。并且在此过程中有机物同时被氧化分解。可用紫外分光光度法于 波长220和275 nm处，分别测出吸光度A220及A275，按照A=A220-2A275的值查标 准曲线并计算总氮含量。
(4)总磷的测定（TP)
81
引用中华人民共和国国家标准[102]:水质总磷的测定一钥酸铵分光光度法 (GB11893-89)。
在中性条件下用过硫酸钾使试样消解，将所含磷全部氧化为正磷酸盐。在酸 性介质中，正磷酸与钥酸铵反应，在锑盐存在下生成磷钥杂多酸后，立即被抗坏 血酸还原，生成蓝色的络合物。然后用分光光度计测量溶液的吸光度值，通过标 准曲线求得总磷含量。
(5)矿化度分析
引用中华人民共和国石油天然气行业标准[103]:油气田水分析方法（SY/T 5523-2000)。矿化度采用重量法，直接通过水的挥发，根据剩余物质的重量，计 算水的矿化度；另一种方法是将测得的各类主要无机离子的浓度总和作为水的矿 化度。本试验采用第二种方法来计算水质的矿化度。
5.1.2.2含聚废水可生化性分析及提高可生化性的实验研究
本实验采用丑0〇5/00〇„值评价污水的可生化性。在一般情况下，BOD5和 C0DCT值愈大，说明污水的可生化性愈好。可参照表5-1中所列数据评价污水的可
生化性[104]。
表5-1污水可生化性评价参考数据 Table 5-1 Reference of the value of biodegradability
BOD5/CODcr>0.450.3 〜0.450.2 〜0.3
可生化性较好可以较难不宜
5.1.3结果与讨论 5.1.3.1化学水质分析结果
表5-2化学水质分析结果（单位mg/L, pH值除外）
Table 5-2 the result of water ananylsis (the unit, mg/L, except pH)
总矿化度总氮总磷含油量悬浮物CODCrPAMpH
107602.540.632101285952987.38
污水中聚合物含量大约是300 mg/L，聚合物、油类物质和悬浮物共同组成
82
了稳定的体系，给污水处理带来了一定的困难。
5.1.3.2纯聚丙烯酰胺溶液对COD的主体贡献
配制50、100、150、200、250、300 mg/L的聚丙烯酰胺溶液，并测出各自
的CODcr值，并与理论值比较。聚丙烯酰胺的理论值计算是全部以C3H5ON形式 计算。结果如表5-3
表5-3标准聚丙烯酰胺溶液的COD&值 Table 5-3 The COD values of different HPAM solutions
HPAM 浓度(mg/L)50100150200250300
CODCr 理论(mg/L)107.04214.00321.13428.17535.20642.25
CODCr 实测(mg/L)45.2096.67160.09205.61259.53318.54
对理论值和实测值进行比较，聚丙烯酰胺作为高分子聚合物不能够完全被重 铬酸钾氧化（氧化率在45 %左右），这与其较长的，并且相互交缠的分子链有着 较大的关系（聚丙烯酰胺分子链相互缠绕，并形成不同的构型）。
5.1.3.3气浮作用对聚丙烯酰胺的影响
考察了气浮作用对聚丙烯酰胺的浓度、粘度及CODCr贡献的影响。聚丙烯酰 胺的浓度为300 mg/L。曝气流量为60 L/min。由表5-4可以看出气浮作用对于聚 丙烯酰胺的浓度影响不大而对于粘度影响较大，可能是由于长的聚合物分子链在 气浮作用的剪切效应下发生断裂，所以其粘度降低，其氧化或水解作用不明显， 所以对浓度的影响不大，因此并没有减少聚丙烯酰胺对CODCr的贡献。
表5-4气浮作用对聚丙烯酰胺溶液(300mg/L)的影响 Fig 5-4 The effect of floating on HPAM solution (300mg/L)
时间（d)135710
浓度（mg/L)301298296294289
粘度（m-Pa)6460524336
CODCr (mg/L)314.7309.5311.2304.9307.5
83
5.1.3.4聚丙烯酰胺对BOD的主体贡献
测定了蒸馏水配制的不同聚丙烯酰胺溶液的BOD5值和添加无机营养盐后聚 丙烯酰胺溶液的BOD5值。添加的无机营养源按选择性培养基的配方比例添加。
由表5-5可知纯HPAM溶液的BOD5值都较低，说明纯HPAM溶液不容易被 微生物利用。而添加了无机营养源的HPAM溶液的BOD5有了很大程度的提高， 这也为含聚污水的可生化性调整提供实验基础。
表5-5不同浓度的聚丙烯酰胺溶液的BOD5值 Table 5-5 The BOD5 values of HPAM solutions
HPAM 浓度（mg/L)50100150200250300
纯HPAM溶液的BOD5值（mg/L)132230384653
添加无机营养盐后的HPAM溶液BOD5值（mg/L)33587089100120
5.1.3.5污水的可生化性及可生化调整
分析了污水的可生化性结果见表5-6:
表5-6污水可生化性分析及可生化调整结果 Table 5-6 The biodegradability analysis and adjustment of wastewater
BOD5 (mg/L)COD& (mg/L)BOD5/CODCr
含聚污水1205160.233
可生化调整后的含聚污水2445950.410
通过实验得出胜坨污水的BOD5/CODcr的值在0.3以下，根据可生化性标准， 污水的可生化性较难，需对污水进行可生化性调整。
由污水的化学水质分析结果表明，污水中的氮源和磷源严重不足，为了增强 微生物的活性，需外加氮源和磷源来提高废水的可生化性。实验采取曝气和添加 营养（NaNO3、K2HPO4、KH2PO4、酵母浸粉等）对污水可生化性的调整。
曝气的作用不仅可以使污水中底部的油和悬浮物质浮到水的表面上，而且可 以通过降低CODcr提高BOD5/CODcr的比值，此外气浮过程还可以向污水中提供 微生物新陈代谢所需的氧气，促进了微生物的活动；向污水中加入营养可以加速
84
微生物的生长繁殖，提高微生物的活性，从而提高微生物降解有机物的能力。可 生化性调整后污水的BOD^/CODcr的值由0.245提高到0.410,根据可生化性划分 标准，污水较易生化，从而可以应用生化技术进行处理。
5 2静态模拟实验
5.2.1实验材料与仪器
5.2.1.1主要实验材料
胜坨油田采出水、自制生化池、、生化池填料、菌株PM-2和PM-3。
美国哈希公司 北京艾诺威商贸有限公司 日本尼康公司 日本岛津
广东日生集团有限公司 玉环求精医用仪器厂 上海山连实验设备有限公司
DI2500 COD快速测定仪 ET9924A BOD 测定仪 YS100显微镜 UV-2450型紫外分光光度计 ACO-003曝气泵 XB-K-25血球计数板 SHP-150生化培养箱
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5.2.1.2主要实验仪器
5.2.1.3实验装置与流程图
图5-1室内静态模拟生化试验装置 Fig 5-1 Static simulating biological test device
5.2.2实验内容与方法 5.2.2.1生物膜的培养与驯化
生化法处理污水主要是依靠附着生长在填料表面上的生物膜的氧化分解能 力，因此在运行之前必须是填料上长出生物膜，这一过程称为挂膜。目前常用的 挂膜方式有自然挂膜法、活性污泥挂膜法和优势菌种挂膜法[105]。本实验采用优 势菌种挂膜法。
向生化池中倒入约3/4体积的污水，加入NaNO3、K2HPO4、KH2PO4、酵母
浸粉等营养成分。曝气一周，在此期间每天向生化池中加入已活化的PM-2和 PM-3混合菌，并定时观察生化池中生物膜上细菌的数量。从生物膜中部剪下2 片约1 cm2的膜片，放在盛有10 mL的无菌水的血清瓶中振荡使细菌释放在无菌 水中。细菌的计数采用血球计数板计数法。优势菌PM-2和PM-3的检测采用平板 计数法。
86
5.2.2.2生物降解指标的检测方法
对污水中聚合物含量、含油量、COD&等指标进行检测。检测方法同5.1.2.1。 5.2.3结果与讨论
5.2.3.1生物膜的培养与优势菌检测 所采用的膜填料如下图所示：
图5-2生物填料
Fig. 5-2 Biologic filling
向生化池污水中按体积比例加入NaN〇3 0.2 g.L-1、K2HPO4O.5 g.L-1、KH2PO4
g-L-1、酵母浸粉0.5 g.L-1营养成分，曝气一周，在此期间每天向生化池中加入50
mL已活化的PM-2和PM-3混合菌，并定时观察生化池中生物膜上细菌的数量。
检测到生物膜上的细菌如图所示：生物膜上的细菌大多为杆菌，这与投加的 PM-2菌的形态很一致。
图5-3生物膜上的细菌
Fig.5-3 Bacteria in membrane
运用血球计数板计数法检测到生物膜上的细菌数如表5-7所示。
87
表5-7生物膜上的细菌随时间的变化
Table 5-7 The change of biomass in membrane followed by the time
天数1 2 3 4 567
细菌数(107cell/cm2)1.6 3.7 5.4 6.5 7.88.58.3
由上表可以看到7天后检测到生物膜上的细菌的密度达到大约8X107 cell/cm2,并达到稳定期。
运用平板计数法（平行5次）测得的一周后生物膜上的降解菌PM-2和PM-3 的细菌量如表5-8:
表5-8生物膜上的优势菌量 Table 5-8 The biomass of dominant bacteria in membrane
次数12345
细菌数(107cell/cm2)4.535.56.57
平均数(107cell/cm2)5.3
一周之后生物膜上投加的降解菌的密度达到5.3X107cell/cm2,为优势种群。 5.2.3.2生物降解的指标检测
将驯化好的生物膜转移到含有新加入的污水的生化池中，加入NaNO3等营养 后，曝气一周，期间进行聚合物含量、含油量、COD&的检测。检测结果如图5-4。
Time / day
图5-4污水各项指标随时间的变化 Fig.5-4 The change on content of each index with time in wastewater
由图中数据可以看出经过3天的降解作用，出水的各项指标趋于稳定。7天
88
后，聚丙烯酰胺浓度为60 mg.L-1左右，降解率达到80 %,含油量为10 mg.L-1左 右，在生物膜的吸附以及微生物的共同作用下，原油总的去除率为95%，出水的 COD&为80 mg.L-1，COD&的总的去除率达到86 %。
5 3动态模拟实验
5.3.1实验材料与仪器
5.3.1.1主要实验材料
主要实验材料同5.2.1.1。
5.3.1.2主要实验仪器
美国哈希公司 北京艾诺威商贸有限公司 日本尼康公司 日本岛津
保定兰格恒流泵有限公司 广东日生集团有限公司 玉环求精医用仪器厂 上海山连实验设备有限公司
DI2500 COD快速测定仪 ET9924A BOD 测定仪 YS100显微镜 UV-2450型紫外分光光度计 BT300-1J蠕动泵 ACO-003曝气泵 XB-K-25血球计数板 SHP-150生化培养箱
5.3.1.3实验装置与流程图
装置由气浮池和生化池三部分组成。污水先进入气浮池，通过气浮，除去大 部分的浮油和较轻的悬浮物，在蠕动泵的作用下进入生化池，在生化池中，通过 曝气和微生物的作用，将污水中的大部分有机物分解代谢，静置一定时间后，出 水。
89
图5-5动态模拟实验装置图
Fig 5-5 Dynamic simulating biological test device
5.3.2实验内容与方法 5.3.2.1生物膜的培养与驯化
生物膜的培养与驯化同5.2.2.1。
5.3.2.2生物降解指标的检测方法
生物降解指标的检测方法同5.2.2.2。
5.3.3结果与讨论 5.3.3.1水力停留时间的确定
生物膜的培养与驯化与静态模拟实验中相同。在前面考察对聚丙烯酰胺降解 时，降解菌对聚丙烯酰胺的降解率3天后基本达到一个稳定值。所以在本实验中， 曝气一周后，将水力停留时间逐渐缩短为3天。用平板计数法检测生物膜上的降
90
解菌PM-2和PM-3的生物量。结果如下表：
表5-9生物膜上的生物量 Table 5-9 The biomass in membrane
次数12345
细菌数(107cell/cm2)3.5465.53
平均数(107cell/cm2)4.4
降解菌的生物量达到4.4X 107 cell/cm2
5.2.3.2生物降解的指标检测
将驯化好的生物膜转移到新鲜的污水中，将水力停留时间调整为3天。在此 期间检测出水聚合物含量、含油量、CODcr的变化。
图5-6污水各项指标随时间的变化 Fig.5-6 The change on content of each index with time in wastewater
由图中数据可以看出经过3天以后，出水的各项指标趋于稳定，聚丙烯酰胺 浓度稳定在100 mg.L-1左右，降解率达到67%，由于气浮作用除去了大部分的浮 油，进入生化池的含油量大约在70 mg_L-1左右，在微生物的作用下，原油被降 解为15 mg-L-1左右，原油总的去除率为93 %，出水的CODcr稳定在120 mg-L-1， COD&的总的去除率达到80 %。
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5 4本章小结
在对含聚污水水质分析和可生化性分析的基础上对污水进行可生化性调整。 运用生物接触氧化法对污水进行了生化处理模拟实验。模拟实验分为静态模拟和 动态模拟两部分进行。结果如下：
1)静态模拟实验，降解7天后，聚丙烯酰胺降解率达到80%，原油总的去 除率为95 %，COD&的总的去除率达到86 %。
2)动态模拟试验，3天以后，出水的各项指标趋于稳定，聚丙烯酰胺的降 解率达到67 %，原油总的去除率为93 %，出水的COD&总的去除率达到80 %。
92
6结论与展望 6.1结论
该论文以胜坨含聚污水为研究对象，针对含聚污水中聚合物含量高、含油高、 现有工艺处理困难等问题，进行了生化污水处理技术处理含聚污水的研究。为油 田含聚污水的生化处理提供理论基础。通过实验研究，主要研究结论概括如下：
1)对本论文所用的聚丙烯酰胺的理化性质进行了测定。聚丙烯酰胺的固含量 为97.59 %，水解度为23.3 %，粘均分子量为1.71X107。对聚丙烯酰胺降解影响 因素进行了探讨。pH值、光照和矿化度对聚丙烯酰胺的粘度影响较大，而对于 聚丙烯酰胺的浓度影响较小。低温和低的机械剪切强度对聚丙烯酰胺的粘度和浓 度影响都不大，而高温和高的机械剪切强度对聚丙烯酰胺的粘度和浓度影响都比 较大。对聚丙烯酰胺的评价方法进行了优化，以浓度评价聚丙烯酰胺降解为主， 粘度和分子量评价为辅；在浓度评价方法中采用淀粉-碘化镉法，并对其测定条 件中的缓冲溶液的pH值进行了优化，测定的缓冲溶液的最佳pH值为3.5。
2)初步筛选到三株好氧的聚丙烯酰胺降解菌种，分别命名为PM-2、PM-3、 PM-4。通过生理生化性质和16S rDNA鉴定，PM-2为蜡样芽胞杆菌，PM-3为枯 草芽孢杆菌，PM-4为苍白杆菌。将三株菌进行混合正交培养后，优化出PM-2 与PM-3的混合菌降解效果最好，300 mg"L-1聚丙烯酰胺溶液的降解率最高可达到 42%。优化了混合菌降解条件，最佳降解时间为3天，连续活化次数为4次，接 种体积分数为3 %，温度为35 - 45 °C，初始pH值为6.0 - 6.5，摇床转速为140 r-min-1，矿化度为 2500 -10000 mg-L-1。
3)探讨了细菌对聚丙烯酰胺的利用情况，结果表明聚丙烯酰胺既可以作为 氮源利用也可以作为碳源利用，通过扫描电镜、红外分析、差热分析、紫外分析 以及液相分析等手段对生物降解前后的样品的表征的基础上对微生物好氧降解 聚丙烯酰胺的机理进行了初探。在其分泌的胞外酰胺酶的作用下聚丙烯酰胺先被 作为氮源利用，在其生长和代谢过程中，聚丙烯酰胺被断裂为小分子有机物，又 可以作为碳源被细菌利用。
4)在对含聚污水水质分析和可生化性分析的基础上对污水进行可生化性调
93
整。运用生物接触氧化法对污水进行了生化处理模拟实验。模拟实验分为静态模 拟和动态模拟两部分进行。静态模拟实验中，降解7天后，聚丙烯酰胺降解率达 到80 %，原油总的去除率为95 %，COD&的总的去除率达到86 %。动态模拟 试验中，生化处理3天以后，出水的各项指标趋于稳定，聚丙烯酰胺的降解率达 到67 %，原油总的去除率为93 %，出水的COD&总的去除率达到80 %。
6.2存在问题及展望
由于时间及实验条件的限制，论文中还存在一些不足之处，需要在以后工 作中进一步完善，具体如下：
1)论文中微生物降解聚丙烯酰胺的机理有待于更深入的探讨，所以结合气 质联用、核磁共振技术加强对代谢产物的分析，有助于深入探讨微生物对聚丙烯 酰胺的降解机理。复合菌因可能具有协调机制，具有较高降解效果，但具体的机 制尚未清楚，研究其协调机制将是下一步实验探索的重点。
2)为考察细菌在污水中的生长繁殖情况，本文中采用传统的镜检法和绝迹 稀释法检测生物量，此方法繁琐耗时且精确度较差；为准确跟踪细菌在生化池中 的生长繁殖情况可采用PCR-DGGE (聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳）和 T-RFLP (末端限制性酶切片段长度多态性）技术对水中微生物进行跟踪、监控。
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