改性聚丙烯酰胺固定化苯酚降解菌的研究：
改性聚丙烯酰胺固定化苯酚降解菌的研究，利用自制的改性聚丙烯酰胺为载体包埋苯酚降解菌，考查了该载体对细胞性能的影响，比较了 4种固定化方 法——改性聚丙烯酰胺法、聚丙烯酰胺法、海藻酸钙法和聚乙烯醇■海藻酸钙法包埋微生物细胞的优劣。实验结果表明，单 体丙烯酰胺经改性后制得的改性聚丙烯酰胺对微生物细胞活性无影响。以其为载体固定苯酚降解菌，其细胞相对活性比 聚丙烯酰胺法高出了 42 4%;比海藻酸钙法高出了 16 4%;比聚乙烯醇■海藻酸钙法高出了 44 3%,表明改性聚丙烯酰胺包 埋细胞更有利于细胞的增殖和活性恢复。重复应用实验表明，改性聚丙烯酰胺法得到的细胞凝胶，机械强度好，有弹性，可 多次重复利用。改性聚丙烯酰胺作为细胞固定化载体其优点是交联速度快、聚合放热温度低、在侧链发生交联反应、抗水 解能力强、无毒、凝胶寿命长。
微生物细胞固定化方法中，以包埋法最为常用。 作为包埋载体，天然高分子多糖类的海藻酸钠和卡 拉胶应用最多，它们具有固化、成型方便，对微生物 毒性小及固定化密度高等优点。但它们抗微生物分 解性能较差，机械强度较低、使用寿命短。这两种载 体的凝胶虽然可以用交联剂进行稳定化处理，但活 性和传质性能又会下降。合成高分子化合物中常用 的载体物质有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光硬化树脂
强度高，化学性能稳定。但是聚合物网络的形成条 件比较剧烈，对微生物细胞的损害较大 。尤其是 聚丙烯酰胺作为微生物细胞包埋固定化载体，虽然 其机械强度、化学稳定性、抗微生物分解性能及价格
低廉等都优于其他合成高分子载体，但因其单体丙 烯酰胺的细胞毒性、环境毒性、聚合反应时间长、聚 合温度高等问题，严重影响了其在食品、制药、环保、 新能源开发及化学合成等领域固定化微生物细胞或 固定化酶的使用。本研究以改性聚丙烯酰胺、聚丙 烯酰胺、海藻酸钠和聚乙烯醇为载体，对苯酚降解菌 进行包埋，考察改性聚丙烯酰胺载体对细胞性能的 影响。为该载体的进一步开发和应用奠定理论 基础。
1材料与方法
11实验药品
丙烯酰胺（AM)、甲醛、三乙胺、过硫酸铵、N，N- 亚甲基双丙烯酰胺、N，N，NC NC四甲基乙二胺、甲 酸钠、海藻酸钠、聚乙烯醇、苯酚、4氨基安替比林 (均为分析纯），苯酚降解菌NT-1(沈阳化工学院生 物工程实验室保藏菌种）。
1 2室温交联聚丙烯酰胺的合成方法
将计量的丙烯酰胺单体水溶液、甲酸钠、过硫酸 铵放入反应器中，升温并恒定在一定温度，反应一定 时间，得到低分子量的聚丙烯酰胺[2]。向低分子量 聚丙烯酰胺溶液中加入计量的甲醛溶液，调节pH 值，加热并恒定在一定温度，反应一定时间，得到 N-羟甲基化聚丙烯酰胺。然后调节温度，加入与甲 醛等摩尔的丙烯酰胺，恒温反应一定时间后，得到改 性聚丙烯酰胺溶液。改性聚丙烯酰胺固定化苯酚降解菌的研究，其低分子量聚丙烯酰胺、甲醛、 单体丙烯酰胺的质量比为1: 0. 6: 0. 6改性聚丙烯 酰胺的固含量为12. 98%。
1 3苯酚降解菌NT-1菌悬液的制备
从苯酚降解菌NT-1斜面挑取菌台两环接种到 50mL苯酚浓度为200mg/L的无机盐培养液中，在 温度为30°C，转速为120 r/min的条件下振荡培养 24 h后，将培养液在7 000 r/mh条件下离心10 min倒去上清液后，倒入适量的无机盐培养液，制成 一定浓度的菌悬液备用。
1 4细胞固定化方法
改性聚丙烯酰胺法：按文献[4]取一定量的改 性聚丙烯酰胺，按2% (V/V)的比例加入配制好的 菌悬液（OD380 = 0■ 500)与之充分混匀，按配比依次 加入N，NC亚甲基双丙烯酰胺、N，N，NC NC四甲基 乙二胺、过硫酸铵溶液混匀，室温下静置3~ 5 min， 即得到固定化细胞凝胶。使用前将其切成粒径约为
聚丙烯酰胺法、聚乙烯醇-海藻酸钙法和海藻酸 钙法分别按文献[5]、[ 6]的方法制备固定化细胞凝 胶，固定化细胞量与改性聚丙烯酰胺法相同。
15苯酚降解实验[3]
250mL三角瓶装苯酚含量为400mg/L的无机
盐培养液50 mL，加入上述固定化细胞凝胶或与该 固定化细胞凝胶固定菌量相同的游离菌体，在 30 °C、120 r/mh的摇床上振荡培养，定时测定苯酚 浓度，计算苯酚降解率。苯酚浓度的测定采用4氨 基安替比林直接光度法。待苯酚降解率超过90% 后，滤出固定化细胞凝胶，用蒸馏水清洗后进行下一 批次的苯酚降解实验。
2结果与讨论
21固定化载体及固定化方法对细胞活性的影
响[17]
2 1 1改性聚丙烯酰胺与单体丙烯酰胺对细胞活 性影响的比较
取0.1 mL菌悬液加入到5mL不同浓度的固定 化载体水溶液中浸泡，其作用时间与完成固定化过 程所需的时间相同，然后将其加入到苯酚无机盐溶 液中，按1 5所述的实验方法进行苯酚降解实验，同 时以不加菌悬液的5 mL不同浓度的固定化载体水 溶液为对照，每组设3个重复实验。2 h后取样测定 苯酚浓度，取其平均值计算苯酚降解率，以苯酚降解 率表示该反应体系中细胞的活性。结果见表1。
表1改性聚丙烯酰胺与单体丙烯酰胺对微生物活性的影响 Table1 Effect ofmodified polyacrylsm ide and
acrylamide monomer on m crobial activity
改性聚丙烯酰胺浓度（％ )单体丙烯酰胺浓度（％ )
0 5 9 130 5 9 13
细胞相对 活性（％ )*丄⑴ 100 100 100100 52 9 31 4 19 6
*细胞相对活性（％)=(固定化材料中细胞活性/游离细胞活 性）@ 100%
表1的结果表明：改性聚丙烯酰胺对微生物细 胞活性无影响，改性聚丙烯酰胺固定化苯酚降解菌的研究，而单体丙烯酰胺对微生物细胞的活 性有强烈的抑制作用。当单体丙烯酰胺的浓度为 5%时，细胞的相对活性为52. 9%，随着单体丙烯酰 胺浓度的増大，细胞的相对活性在逐渐的减小，当浓 度为13%时，细胞的相对活性仅为19. 6%。说明单
大。而改性聚丙烯酰胺对细胞无毒性。
2 1 2 4种固定化方法对细胞活性的影响
按照1 4所述的实验方法包埋NT-1苯酚降解 菌，取0. 1 mL苯酚降解菌的菌悬液和含有Q 1 mL 苯酚降解菌的固定化细胞凝胶及等量的不含菌的固 定化凝胶按1.5所述的实验方法进行苯酚降解实 验，每组设3个重复实验。2 h后取样测定苯酚浓 度，取其平均值计算苯酚降解率，以苯酚降解率表示 该反应体系中细胞的活性。结果见表2„
表2 4种固定化方法对细胞活性的影响
Table 2 Effect of four mmobilization methods on cells activity
固定化方法改性聚丙烯 酰胺法聚丙烯
酰胺法海藻
酸钙法聚乙烯醇- 海藻酸钙法
固定化细胞 相对活性（％ )*78. 836. 462 434 5
固定化时间（min)3~ 51801 4401 440
*固定化细胞相对活性（％)=(固定化细胞活性/游离细胞活 性）@ 100%
表2的结果表明:不同的包埋方法对细胞活性 的影响不同。用改性聚丙烯酰胺法固定的微生物细 胞，其相对活性最高，为78. 8%，比聚丙烯酰胺法高 出了 42.4%，比海藻酸钙法高出16. 4%。同时固定 化操作容易，固定化时间短。在包埋实验中由于所 制备的固定化细胞凝胶量较少，因此交联放热少、散 热快，聚合热对微生物活性的影响没有体现出来。 如果考虑聚合热对微生物活性的影响，则改性聚丙 烯酰胺法能更优于聚丙烯酰胺法。因为改性聚丙烯 酰胺的交联点是在聚丙烯酰胺的侧链上，只是交联 剂和侧链丙烯酰胺基团的聚合反应，因此聚合温度 接近室温。
2 2固定化细胞凝胶的重复使用效果
按照1 4所述的实验方法包埋NT-1苯酚降解 菌，改性聚丙烯酰胺固定化苯酚降解菌的研究，取含有0. 1mL苯酚降解菌的固定化细胞凝胶按 1. 5所述的实验方法进行苯酚降解实验，每组设两 个重复实验。定时取样测定苯酚含量，至苯酚降解 率达90%以上即可更换批次。每次更换时，先将培 养液倒净，再将固定化凝胶用蒸馏水冲洗后倒入干 净的三角瓶中，加入新鲜的苯酚无机盐培养液，重复 上述实验过程。实验结果见表3〇
表3 4种固定化细胞凝胶的重复使用效果比较 Table 3 Comparison of reuse effects of four mmobilized cellgels
重复使用批次
123456
降解时间（h)271512101010
改性聚丙烯酰胺法
苯酚降解率（％)96 3494. 7593. 5695 3595 9596 14
降解时间（h)463016131313
聚丙烯酰胺法
苯酚降解率（％)96 7493 5692. 3794. 1694. 9595 15
降解时间（h)301814121212
海藻酸钙法
苯酚降解率（％)94. 0092 8193. 8094. 4094. 7995 39
降解时间（h)483518151515
聚乙烯醇■海藻酸钙法
苯酚降解率（％)92 8193 4093. 8093 4093 8094. 20
细胞经过固定化后没有进行细胞増殖培养和活 性恢复，直接加入到苯酚无机盐培养液中进行降解 实验，在降解实验的过程中完成细胞的増殖和活性 恢复。从表3结果可以看出：4种固定化方法对细 胞増殖及活性的影响有很大差别。在相同的实验条 件下，要使载体内的细胞増殖和活性恢复达到稳定 状态，改性聚丙烯酰胺法需要54 h聚丙烯酰胺法需 要92 h海藻酸钙法需要62 h聚乙烯醇-海藻酸钙 法需要109 h在第1批次的实验中，要使苯酚降解
率达96%以上，改性聚丙烯酰胺法比聚丙烯酰胺法 少用了 19 h，比海藻酸钙法少用了 3 h多，比聚乙烯 醇-海藻酸钙法少用了 20 h多。说明改性聚丙烯酰 胺法对细胞的増殖和活性影响较小。改性聚丙烯酰胺固定化苯酚降解菌的研究，经过3个批次 的重复实验后，4种固定化方法的细胞増殖和细胞 降解性能基本稳定。固定化细胞凝胶中的细胞増殖 及性能稳定后要使苯酚降解率达93%以上，改性聚 丙烯酰胺法比聚丙烯酰胺法少用了 3 h多，比海藻
了 5h多。这进一步说明改性聚丙烯酰胺法不但对 细胞的增殖和活性影响较小，可能载体的孔容也要 大于其他3种包埋方法，使得改性聚丙烯酰胺固定 化细胞降解苯酚的速率明显高于其他3种固定化细 胞方法。而且使用6批次后，改性聚丙烯酰胺细胞 凝胶颗粒和聚丙烯酰胺细胞凝胶颗粒的弹性和硬度 无多大变化，而聚乙烯醇-海藻酸钙细胞凝胶颗粒则 膨胀、变软并粘连到一起，海藻酸钙细胞凝胶小球有 部分破损。将使用6批次后的改性聚丙烯酰胺细胞 凝胶保存在无机盐培养液中，在室温下和4 °C冰箱 中贮藏，并分别于3个月、6个月、10个月后进行苯 酚降解实验。结果表明细胞的活性及增殖能力能很 快恢复，凝胶的强度及弹性基本无变化。说明改性 聚丙烯酰胺凝胶机械强度好，寿命长，可多次重复 使用。
2 3改性聚丙烯酰胺固定化细胞与游离细胞降解 苯酚的比较研究
胞起到了保护作用，使其免受苯酚的毒害。因为在 固定化系统中，苯酚需扩散进入载体内部，才能得到 包埋在载体内微生物细胞的分解，扩散作用使得苯 酚浓度从载体外部到内部由高到低，形成浓度梯度， 减轻了有毒物质对载体内微生物的毒性。同时，载 体内部具有较大的孔隙度，可以容纳不断增殖的细 胞，致使载体内细胞不断利用水中的苯酚进行繁殖, 增大细胞密度。因此，使得固定化细胞降解苯酚的 速率与游离细胞相比得以较大幅度的提高。
3结论
单体丙烯酰胺经改性后制得的改性聚丙烯酰胺 对微生物细胞活性无影响。以改性聚丙烯酰胺为载 体固定微生物细胞，其细胞相对活性比聚丙烯酰胺 法高出了 42.4%;比海藻酸钙法高出了 16. 4%;比 聚乙烯醇-海藻酸钙法高出了 44 3% ,进一步表明改 性聚丙烯酰胺包埋细胞更有利于细胞的增殖和活性
将改性聚丙烯酰胺固定化细胞凝胶（含菌悬液恢复。改性聚丙烯酰胺固定化苯酚降解菌的研究，固定化细胞凝胶重复使用实验表明，改性聚 0. 1mL)和与该固定化细胞凝胶固定菌量相同的游丙烯酰胺法得到的细胞凝胶，机械强度好，有弹性， 离菌体分别置于50 m!、苯酚初始浓度分别为可多次重复利用。因此，改性聚丙烯酰胺可以作为 400mg/L和800mg/L的无机盐培养液中，于30°C、固定化细胞的载体。其优点是固定化操作简单、交
洱7. (X 120 r/m in条件下振荡培养。对比固定化细
胞和游离细胞对苯酚的降解情况，结果如图1所示。
图1改性聚丙烯酰胺固定化细胞与游离细胞 降解苯酚的比较
F g 1 Comparison of phenol degradati)n by modified p〇]kracr^r]amide and free cell
联速度快、聚合放热温度低、对细胞的毒性和损害 小、抗水解能力强、机械性能好及使用寿命长等。改性聚丙烯酰胺固定化苯酚降解菌的研究，该 载体的开发将为食品、制药、环保、新能源开发及化 学合成等领域固定化微生物细胞或固定化酶的制备 技术探索一条新路。
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