活性污泥中细菌对聚丙烯酰胺的生物降解研究：
活性污泥中细菌对聚丙烯酰胺的生物降解研究，聚丙烯酰胺(P〇lyacrylamide，PAM)是一类重要的水溶性高分子聚合物，已广泛应用到工农业生产的各个领域和人们的日 常生活中。同时，PAM在环境中的残留、迀移和降解对环境的污染也日趋严重，尤其是降解后的单体丙烯酰胺对人类的神经系统有 很大的危害。本文从胜利油田的活性污泥中筛选出3株聚丙烯酰胺降解菌，通过比较筛选出一株降解效果较好的菌，命名为AS-2。 根据生理生化特性分析，初步鉴定为海球菌属。采用室内培养方法，研究了 AS-2对聚丙烯酰胺生物降解的最佳条件。结果表明，当 降解时间为5d，pH=8,温度为40^，碳源为原油，氮源为NaN〇3,原油和NaN〇3的含量分别为2.5，1.4giL-1时，AS-2对聚丙烯酰胺 的降解率达到45.23%。通过对聚丙烯酰胺生物降解前后的红外谱图比较，推断出AS-2主要降解了聚丙烯酰胺侧链的酰胺基，将酰 胺基降解为羧酸和游离的氨基。用高效液相色谱检测生化后的PAM溶液，未检测出单体丙烯酰胺。
聚丙烯酰胺(Polyacrylamide, PAM)是丙烯酰胺及 其衍生物的均聚物和共聚物的统称，为线性水溶性高 分子的一种，亲水性高，能以各种百分比溶于水，不溶于大多数有机溶剂。它是应用最广泛的水溶性高分子 化合物之一，并享有“百业助剂”之称[1]，不仅己广泛应 用在石油开采、水处理、纺织、造纸、制糖、选矿、医药、 建材、农业等领域，而且在食品、药品以及整容等与人 们日常生活和人类健康相关的领域也都有应用。
在我国，聚丙烯酰胺的消费现状为:采油工业是 第一大用户，占总需求量的80%左右，第二位是水处 理，约占9%，造纸占5%，矿山占2%，其他占3%。在 采油工业中，聚合物驱油3次采油技术己进入大面积。
工业化推广应用阶段[2]。聚合物干粉年注入量己达万 吨以上，预计到2010年，我国石油开采行业PAM需 求量为10~11万t，占总需求量的80%左右，其规模 在世界处于遥遥领先地位[3]。伴随而来的是大量含有 一定浓度及保留一定黏度的聚合物产出水，大庆油田 有些采油厂采出水中PAM的浓度己经高达1 000 mg • L-1以上[4]。含聚丙烯酰胺(PAM)污水中残留单体丙烯 酰胺(AM)的毒性很大[5]，如直接排放，将在环境中逐 渐积累，危害环境，然而现有工艺无法满足处理要求， 需要对PAM降解的途径和机理进行全面深入的研 究，寻找合适的处理方法。
本文从胜利油田的活性污泥中初步筛选到3株 聚丙烯酰胺降解菌，通过探索性实验筛选出适合微生 物降解聚丙烯酰胺的优化条件。
1材料与方法
1.1实验仪器
DSHZ-300多用途水浴恒温振荡器、SHP-150生化 培养箱、LDZX-50FAS立式电热压力蒸汽灭菌器、 YS100显微镜、721型分光光度计、pH计、红外光谱仪 (AVATER360FT-IR)、高效液相色谱仪(AgilentllOO)。
1.2培养基
基础培养基(g‘L-):蛋白胨5,牛肉膏10，NaCl5。 去离子水1 000 mL。
降解培养基L-):聚丙烯酰胺0.3,葡萄糖2, NaNO31，KH2PO41.5，K2HPO41.5，MgSO4 0.5。去离子水 1 000 mL。
1.3 菌株的筛选和分离
活性污泥中许多微生物接触一段时间后才具备 降解抑制物的能力，因此需对污泥进行驯化。将100 mL胜利油田的活性污泥加到盛有1 000 mL的基础培 养基的烧杯中，置于(35±1)丈的恒温槽中，用鱼缸充 气器进行曝气。先培养活化3d后，每72 h更换1次 混合液，逐步増加含聚污水的浓度(聚丙烯酰胺浓度： 50~500 mg. L-)，培养驯化45 d后进行细菌分离。
用平板划线法分离细菌，将平板置于37丈的生 化培养箱中培养48 h后，再挑取不同形态的菌落进 行平板划线纯化细菌。根据菌落形态和显微镜观察结 果，重复划线分离，直到得到纯细菌。然后再对筛选出 的菌种进行生理生化鉴定。
1.4分析方法
1.4.1聚丙烯酰胺质量浓度测定
采用浊度法。生物降解率n (%)的表达式为：
n= (C0-C) /C0X100%
式中:C。表示降解前的聚丙烯酰胺含量，mg^L-1; C1表 示降解后的聚丙烯酰胺含量，mg • L-1。
1.4.2红外光谱分析
聚丙烯酰胺干粉和微生物降解产物，用光谱纯 KBr压片后进行红外光谱分析。
1.4.3高效液相色谱分析
色谱条件:Agilent ZORBAX XDB-C18 柱（3.0 mm x250 mmx5|xm);流动相为Mili-Q水；流速为0.4 mL-min-1;紫外196 nm处监测;进样量为50 |xL。此方 法对丙烯酰胺的检测灵敏度为ppb级[6]。
2结果与讨论
2.1 细菌的筛选和鉴定
从胜利油田的活性污泥中筛选到3株聚丙烯酰 胺好氧降解菌，活性污泥中细菌对聚丙烯酰胺的生物降解研究，分别命名为AS-1、AS-2和AS-3。根 据形态观察和生理生化鉴定，初步鉴定为:AS-1为脂 肪杆菌属，AS-2为海球菌属，AS-3为动性球菌属。
2.2细菌的生长曲线测定
测定细菌生长曲线了解其生长繁殖规律，这对有 效地利用和控制细菌的生长具有重要的意义。在适宜 的条件下，培养细菌要经历延迟期、对数期、稳定期和 衰亡期4个阶段。
采用浊度法分别测定了 AS-1、AS-2和AS-3以 及混合菌在降解培养基中的生长曲线，结果见图1。 从图中可以看出，3株菌和混合菌在前5 h内生长缓 慢，处于生长的延迟期。5 h后细菌浓度大大増加，开 始进入细菌的生长对数期。11 h后，细菌的生长又开 始趋向平缓，这时进入了稳定期，持续一定时间后，细 菌浓度开始减少，进入衰亡期。其中菌株AS-2的生
图I单株菌和混合菌的生长曲线
Kijiurt* I Hu* gniwth curvuture> of single Imcl^riniii ami mixed nactcriu
长较快，细菌浓度较大，是优势菌种。
2.3单株菌和混合菌的降解能力比较
环境污染物的降解有时可通过单株细菌完成，有 时也需要多株细菌间的协作来完成的。同时多株菌共 存可能存在协同作用，提高单株菌对降解物的降解效 果，也可能存在桔抗作用，降低单株菌对降解物的降 解效果。所以，将3株菌正交混合后在降解培养基中 培养，考察对聚丙烯酰胺的降解效果，结果见图2。
图2单株菌和混合菌的降解能力的比较
Figure 2 Tilt* romparismi of degrailution rales of single huctt'rium anti mixed hactrria
不同菌株对聚丙烯酰胺的降解能力存在差异，菌 株AS-2的降解效果最好，菌AS-1和AS-3对聚丙烯 酰胺的降解效果不明显，并且菌AS-1和AS-3对菌 AS-2有明显的桔抗作用。混合培养的降解效果都不如 单株菌AS-2的降解效果。所以菌AS-2为降解聚丙烯 酰胺的优势菌，在后续的实验中对其作深入研究。
2.4菌AS-2降解聚丙烯酰胺的条件优化 2.4.1最佳反应时间的确定
将菌AS-2接入250 mL的降解培养基中，在37 丈，140 •min-1的恒温摇床中振荡培养，间隔一定的 时间测定聚丙烯酰胺的浓度。
从图3可以看出，在前5 d内，菌AS-2对聚丙烯 酰胺的降解效果明显，在第5 d的时候，聚丙烯酰胺 的降解率达到40.51%。而后，随着降解时间的延长， 聚丙烯酰胺降解率増长缓慢。这可能是菌AS-2的代 谢产物所致。由于过长的降解时间不但増加处理成 本，而且不利于实际应用。所以，活性污泥中细菌对聚丙烯酰胺的生物降解研究，选取菌AS-2降解聚 丙烯酰胺的最佳时间为5 d。
2.4.2初始pH的确定
不同的微生物有其最适宜的生长pH值范围，同 一微生物在其不同的生长阶段和不同的生理、生化过 程中，也要求不同的最适宜的pH值。将菌AS-2接入 降解培养基中，分别将pH值调为2、3、4、5、5.5、6、
6.5、7、7.5、8、8.5、9。在 35 U 140 r.min-1 的恒温摇床
中振荡培养5 d后测定聚丙烯酰胺的浓度。实验结果 见图 4。
从图4可以看出，不同的初始pH值对聚丙烯酰 胺的降解有较大的影响。pH值在7~8之间时，聚丙烯 酰胺的降解效果较好。降低或増大pH值，聚丙烯酰 胺的降解率都减小。当pH=8时，聚丙烯酰胺的降解 率最高，达到33.29%。
2.4.3温度的确定
将菌AS-2接入降解培养基中，温度范围为25~ 55丈，pH=8，静置培养4 d后测定聚丙烯酰胺的浓 度。温度对聚丙烯酰胺降解率的影响见图5。当温度 为30~45丈时，AS-2对聚丙烯酰胺的降解效果较好， 在40丈时，聚丙烯酰胺的降解效果达到最好，降解率 达到32.25%。继续升高温度，聚丙烯酰胺的降解率大 幅度下降。所以，40丈为最佳降解温度。
2.4.4最佳碳源的确定
分别选取了 NaHC〇3、乙酸钠、橄榄油、可溶性淀 粉、原油、葡萄糖、蔗糖为碳源，其含量均为2 gl-1，
^/sy 工cmJcl-scsitrK
25303540455055
Teni|K*ra!urf*Ai
图5温度对降解率的影响
Figure 5 Hit* efferl of lempfratun* on dep'adution rulers
2.4.5最佳氮源的选择
分别选取了 NaN〇3、尿素、硫酸铵、蛋白胨、NH4CI 为碳源，其含量均为1g.L-1，pH为8,在37丈、140r- min-1的恒温摇床中振荡培养5d后测定聚丙烯酰胺的 含量。从图7可以看出，氮源为NaN〇3时，菌AS-2对 聚丙烯酰胺的降解效果最好，降解率达到43.75%。 2.4.6碳源、氮源含量的确定
分别考察了原油和硝酸钠含量对菌AS-2降解 聚丙烯酰胺的影响(结果见图8,图9)。实验表明，当 原油含量为2.5 g-L-1，硝酸钠含量为1.4 g-L-1时，菌 AS-2对聚丙烯酰胺的降解效果最好，分别达到了 33.83%和 45.23%。
pH为8,在37140 r.min-1的恒温摇床中振荡培养
5 d后测定聚丙烯酰胺的含量。从图6可以看出，活性污泥中细菌对聚丙烯酰胺的生物降解研究，碳源 为葡萄糖时，菌AS-2对聚丙烯酰胺的降解效果最 好，降解率达到40.73%，碳源为原油时，降解率较低， 为29.70%。但油田的含聚污水中同时也含有原油，所 以从实际应用考虑，选取原油为碳源。
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图7氮源种类对降解率的影响
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图8碳源含置对降解率的影响
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图9氮源含置对聚丙烯®胺的影响
Figiirt* 9 Tlie effecl of NaNO^ content on degradation rat«»s
3菌AS-2对聚丙烯酰胺结构的影响
分别对聚丙烯酰胺降解前后的样品进行了红外 扫描（图10、图11)。从图中可以看出，活性污泥中细菌对聚丙烯酰胺的生物降解研究，经过菌AS-2 降解后的聚丙烯酰胺的红外光谱图发生了明显的变 化。降解后聚丙烯酰胺的谱图中的3 300~3 500 cm-1 处附近-NH2的伸缩性振动特征吸收峰明显变弱，说 明了微生物主要降解了聚丙烯酰胺侧链上的酰胺基。 根据1 364 cm-1和920 cm-1附近出现新的吸收峰，可
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降解前降解后
图丨(）微生物降解前后的聚丙烯酰胺的红外光谱
Figure 10 Hie IK nidiire of PAM before xind after liifNlpgmdatinn
以确定体系中的羧基的存在。1462cm-1处的峰消失和 1082 cm-1处的峰明显变宽变强，活性污泥中细菌对聚丙烯酰胺的生物降解研究，说明氨基可能从聚 丙烯酰胺侧链上脱落下来成为游离的氨基。同时， 530~995 cm-1处出现的几个强的吸收峰代表了芳香 化合物，可能是微生物的代谢产物。所以，可以推断菌 AS-2主要降解了聚丙烯酰胺的侧链，把酰胺基降解 成了羧酸和游离的氨基。
4丙烯酰胺单体的测定
聚丙烯酰胺本身基本无毒，但是它的单体，丙烯 酰胺(Acrylamide, AM)的毒性却很强，它是神经系统
致毒剂，对神经系统有损伤作用，中毒后表现为肌体 无力和运动失调等症状[7]。因此，在PAM的使用过程 中人们非常关注是否有单体释放出来。本文用高效液 相色谱法考察了生化过程中是否有丙烯酰胺单体产 生（图11、图12)。
从图中可以看出，丙烯酰胺标样的保留时间为 3.227 min，活性污泥中细菌对聚丙烯酰胺的生物降解研究，而降解后的PAM溶液的3个峰的保留时 间分别为1.902、2.715、2.929 min均不在丙烯酰胺出
峰处。说明经生化处理后的PAM溶液中没有丙烯酰 胺单体生成。用高效液相色谱检测生化后的PAM溶 液，未检测出单体丙烯酰胺。
5结论
(1)从胜利油田的活性污泥中筛选出3株聚丙烯 酰胺降解菌，通过比较筛选出一株降解效果较好的菌 AS-2。研究了 AS-2对聚丙烯酰胺生物降解的最佳条 件。结果表明，当降解时间为5 d、pH=8、温度为40 丈、碳源为原油、氮源为NaN〇3、原油和NaN〇3的含量 分别为2.5、1.4 g，L-1时，AS-2对聚丙烯酰胺的降解 率达到45.23%。
(2)分别对聚丙烯酰胺降解前后的样品进行了红 外扫描。经过菌AS-2降解后的聚丙烯酰胺的红外光 谱图发生了明显的变化。经过红外分析，可以推断菌 AS-2主要降解了聚丙烯酰胺的侧链，把酰胺基降解 成了羧酸和游离的氨基。结果表明，菌AS-2对聚丙 烯酰胺具有较强的生物降解功能。用高效液相色谱检 测生化后的PAM溶液，未检测出单体丙烯酰胺。
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