聚丙烯酰胺降解细菌的筛选及降解特性:
聚丙烯酰胺降解细菌的筛选及降解特性,聚丙烯酰胺是一种线性高分子化合物，已被应用于石油开采、造纸、农业、水处理、医 药、纺织印染等领域。但是聚丙烯酰胺在环境中存留，会改变土壤和水体的理化性质，影响 水体的COD。聚丙烯酰胺在特殊条件下会发生缓慢降解，其降解后产生的丙烯酰胺（AM) 单体具有很强的生物毒性，会导致人体器官功能和粘膜受损，甚至会导致中枢神经系统受到 损伤。因此，环境中聚丙烯酰胺的降解将成为环境保护者重要关注和研究的课题。
大量研究表明，微生物降解聚丙烯酰胺是消除其引起的环境污染和潜在毒性的有效手段。 由于细菌生长快速，适应性强，如今利用微生物降解聚丙烯酰胺主要集中在细菌上。本研究 采用平板胁迫法，从生产聚丙烯酰胺的大庆市化工厂厂区土壤和排水沟泥水中分离筛选出降 解聚丙烯酰胺的细菌，并进行分子生物学鉴定。同时研究其生长和降解特性，并进一步考察 复合菌的协同作用、降解特性及不同碳氮源对复合菌降解的影响情况。为降解聚丙烯酰胺提 供菌源，为生物处理聚丙烯酰胺污染水体提供技术支持。试验获得的结果如下：
1.试验采用平板胁迫法筛选出3株高效降解菌，初步鉴定为：PAMB3为枯草芽孢杆菌
PAMB7为地衣芽抱杆菌削/5〇; PAMB8为解淀粉芽抱 杆菌（_6如//^〇撕少/〇//糾咖咖《5〇。PAMB3仅能以聚丙烯酰胺为唯一氮源生长；PAMB7和 PAMB8可以聚丙烯酰胺为唯一碳源、唯一氮源和唯一碳氮源生长。
2. 以聚丙烯酰胺为唯一氮源时，PAMB3适宜在环境温度25〜40 °C、底物浓度为200〜 700 mg.L-1、pH值为6〜11生长和降解；在最佳条件30 °C、500 mg.L-1聚丙烯酰胺、pH值 为9.0下，对聚丙烯酰胺降解率为45.1 %。PAMB7适宜在环境温度25〜35 C、底物浓度为 50〜700 mg.L-1、pH值为6〜11生长和降解；在最佳条件30 C、500 mg.L-1聚丙烯酰胺、pH 值为8下，对聚丙烯酰胺降解率为39.9 %。PAMB8适宜在环境温度25〜35 C、底物浓度为 100〜700 mg.L-1、pH值为7〜10生长和降解；在最佳条件35 C、500 mg.L-1聚丙烯酰胺、 pH值为9下，对聚丙烯酰胺降解率为36.2 %。
3.在组合降解实验中PAMB3+PAMB7+PAMB8复合菌（PB378)和PAMB3+PAMB7复 合菌（PB37)降解效果最好。PB378和PB37降解的适合条件是初始聚丙烯酰胺浓度为50〜 1 000 mg.L-1，20〜40 °C„PB378初始pH值范围为5〜12, PB37适合的初始pH值范围为5〜 11。PB378和PB37在最佳条件温度为30 C、底物浓度为700 mg-L-1、pH值分别为9和8 时，对聚丙烯酰胺的降解率分别为58.2 %和57.1 %。
4.不同碳氮源对复合菌降解影响的试验表明，NH4CI、NH4NO3对聚丙烯酰胺降解率分 别为60.88 %、60.43 %和58.83 %、59.49 %;石油对复合菌的生长和代谢无明显影响。但尿 素、牛肉膏和蛋白胨对PB378和PB37降解聚丙烯酰胺具有竞争代谢作用，聚丙烯酰胺降解 率很低。
含聚丙烯酰胺石油采出废水多为碱性，且含有石油，PB378和PB37均适宜石油采出废 水中聚丙烯酰胺的降解。二者降解能力差异较小，建议实际中采用PB378。
研究目的与意义
聚丙烯酰胺（Polyacrylamide，PAM)，是一种线性高分子化合物，具有增稠性、絮凝性、 减阻性、耐剪切性、泥浆处理剂、分散性、净化性、增粘性、沉降性、助留性等[1]。已广泛 应用于多个领域[2]，是应用最广泛的水溶性高分子化合物之一 [3,4]。
近年来，由于我国多数陆地主力油田已进入中后期开发阶段，聚合物驱油技术已经成为 目前应用最广泛的三次采油技术，而且聚丙烯酰胺是聚合物驱油中最常用的物质[5,6]。据相关 资料表明，在我国石油储量中有43.6Xl05kt可大规模使用聚合物驱油技术来提高采收率，如 按平均提高采收率8.6 °%计算，能增加可采石油储量3.8Xl05 kt，需要聚合物2.24Xl05 kt[7]， 到2010年，聚合物驱油已占聚丙烯酰胺消耗总量的81 %[8]。在三次采油的过程中应用聚合 物驱油技术，在采油过程中将聚丙烯酰胺注入油层，使油/水间流度比下降，使水的粘性指数 降低，从而提高是油采收率。
但聚丙烯酰胺会改变油/水混合物的性质，使原油乳化，导致水中含油量和粘度增加，且 污水成分复杂难以降解；同时聚丙烯酰胺的用量和应用范围正呈现快速增长的趋势，其在环 境中的累积、迁移、转化和降解产生的单体丙烯酰胺（AM)会对人和动物周围神经系统产 生永久的、不可修复的损害[9]，并将给生态环境带来长期不可估量的危害，因此处理含聚丙 烯酰胺污水的研究已经迫在眉睫[10]。到目前为止，对含聚丙烯酰胺废水处理的手段主要有物 理处理法、化学处理法和生物降解法等。其中生物降解法是目前最常用的降解聚丙烯酰胺的 方法，这是由于生物降解方法可将聚丙烯酰胺降解具有对环境友好的小分子有机物和无机物、 处理成本低、可进行原位异位处理等优点[11]。
本研究从生产聚丙烯酰胺的大庆市化工厂厂区土壤和沟渠泥水中分离筛选出降解聚丙烯 酰胺的细菌，并进行群落特征、生理生化特征、16SrRNA方法等鉴定。研究其生长和降解特 性。本研究可为降解聚丙烯酰胺提供菌源，为实现聚丙烯酰胺污染的水体生物处理提供技术 支持和理论依据。
1.2聚丙烯酰胺的概述
1.2.1聚丙烯酰胺的性质与分类
1.2.1.1聚丙烯酿胺的性质
(1)物理性质
聚丙烯酰胺是白色粉状物质，为线性水溶性高分子化合物，其分子结构单元中含有亲水 基酰胺基，溶于水中易形成氢键，在水溶液中分子呈团状，能以各种比例溶于水，但几乎不
溶于多数有机溶剂，水溶液为透明的粘稠液体，固体聚丙烯酰胺有较高的吸湿性。聚丙烯酰
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胺本身是非危险品，无毒、无味、无腐蚀性。是应用最广泛的水溶性高分子化合物之一[12]。 按形状可分为粉状、胶体、乳浊液和水溶液，按分子量又可以分为高分子量（1 000万以上）、 中分子量（100万〜1 000万）、低分子量（100万以下）。
(2)化学性质
聚丙烯酰胺是丙烯酰胺及其衍生物的均聚物和共聚物的统称。其分子结构如下：
一 CH2—CH—CH2—CH—CH〗一CH—
I I I
CONH2CONH2CONH2
化学性质主要表现为分子链断裂降解反应和酰胺基的化学反应[13]。主要体现在水解性、 分散性、絮凝性。受酰胺基的影响，聚丙烯酰胺分子还可发生霍夫曼降解反应、曼尼希反应、 磺甲基化反应和氢甲基化等，生成各种聚丙烯酰胺衍生物。
1.2.1.2聚丙烯酿胺的分类
根据电荷性质可将聚丙烯酰胺分为非离子型聚丙烯酰胺（NPAM)、阴离子型聚丙烯酰胺 (APAM)、阳离子型聚丙烯酰胺（CPAM)和两性聚丙烯酰胺（AmPAM) [14]。
1.2.2聚丙烯酰胺的应用与危害
1.2.2.1聚丙烯酿胺的应用
聚丙烯酰胺是一种化学性质比较活泼大分子物质。其侧链上的酰胺基活性较强，能发生 多种化学反应并获得多种衍生物，正是这些的性能使其在水处理、石油开采、造纸、纺织印 染、洗煤、选矿、医药、养殖、制糖、农业、建材等行业都具有应用广泛[15]，而且近年来聚 丙烯酰胺也应用在食品、药品[16]以及整容等与人类健康和日常生活相关的领域[17]。其消耗结 构为：石油开采工业占总需求量的80 %左右，水处理约占9 %，造纸业占5 %，矿业占2 %， 其它占3 %[18]。据报道，1997年世界年需求量为65万吨[19]，到了 2008年世界聚丙烯酰胺消 费量已达到84万t[20]。聚丙烯酰胺最早于1893年由德国科学家Moureu合成，1952年由美 国道化学公司于申请专利权，并于1954年开始工业生产。我国第一条聚丙烯酰胺生产线于 1966年由兰州白银有色金属公司建立[21]。2005年，我国市场共需聚丙烯酰胺14.2万吨[22]。
(1)在石油开采中的应用
在石油开采中，聚丙烯酰胺主要被用作钻井泥浆材料以及提高石油采收率，被广泛应用 于钻井、完井、固井、压裂和强化采油等油田开采作业中，具有流变调节、增粘、剖面调整、 胶凝、分流等功能[23’24]。
最早于20世纪50年代末聚丙烯酰胺开始应用于石油开采方面[25]，主要用于石油勘探与 开采的泥浆添加剂和选择性堵水剂等。在分离提取石油时使用聚丙烯酰胺产品，可使才有率 提高20 %〜50 %。在一些发达国家进行了大量聚合物驱油工业化试验，结果表明，聚合物驱
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油一般可使石油采收率提高6 %〜17 %，在我国三次采油技术已成为聚丙烯酰胺应用的最大 领域[26]。聚合物驱油技术适用于我国石油开采，经过多年的研究，目前，该技术已在油田进 行大范围工业化推广，而且驱油效果较好。在我国三次采油技术已得到大范围的推广，并且 其技术己达到世界领先水平。
为了减少采出水对环境的污染、淡水资源的浪费和回收采出水中的石油，为提高社会效 益和经济技益，多数情况下降经处理的采出水回注于油层。在油田开发的不同时期采出水处 理，均占有着重要的地位。伴随油田的发展，油田开发已进入的不同时期，油田采出水处理 方法可分为三个阶段。
第一阶段：在油田开发初期，为含水量低时的水处理阶段。此阶段石油开采时利用天然 能量的阶段。石油被覆盖于石油层上的岩石对其所处的地层及流体的压力挤压下经油井出口 到达地面。随着原油及天然气的产出，油层岩石与流体体积比变大，使弹性势能也逐渐释放。
第二阶段：从1991年开始该阶段，油田中石油含水量由低逐步变大。此阶段主要针对处 理后达高渗透的油层，通过注气或注水等方法向油层补充能量，提高油层压力。通过以上方 法可提高油层压力，以提高地层中的岩石和流体的弹性势能，建立新的压力差，从而采出仅 靠天然能量不可采出的石油。但由于地层性质非均匀，注入的流体会沿阻力最小的方向流动， 使阻力相对较大区域的石油无法被驱替出来，即使是被注入流体流过的区域，也依然存在一 定数量石油，由于岩石的吸附作用无法被采出。另外，部分石油无法多孔介质中流动，所以， 二次采油虽能提高采油效率，但能力有限。
第三阶段：从1997年设计建站开始，是聚驱开采时期的采出水处理阶段。在该阶段，通 过各种物理、化学方法，来改变油层流体和油层之间的粘度，增加石油的流动能力，驱替油 层中不连续和难于开采石油，从而使石油随着添加物质共同采出。主要原理是应用化学物质、 蒸气、添加剂或微生物等注入油层，使油水混合界面性质或原油本身物化性质改变[27]。该方 法所添加聚合物的主要成分为聚丙烯酰胺类。
聚合物驱油是将一定量相对分子量较高的聚合物注入水中，增加黏度改变流度比。由于 含聚丙烯酰胺的注入水黏度较高，通过油层时有较高残余阻力系数。随着黏度的升高，残余 阻力系数会变大，使驱替相的流度随之便小，导致驱替相与被驱替相的流度减小，聚合物对 油层宏观和微观波及效率的扩大作用就会随之增大，由此使采收率提高[28]。目前应用的水溶 性聚合物主要有生物聚合物和聚丙烯酰胺类聚合物。近年来丙烯酰胺多元共聚物迅速发展， 使之成为20世纪80年代发展起来的重要油田处理剂之一[29]。
(2)在农业中应用
我国是世界上水土流失较严重的国家之一[30,31]，现有水土流失面积约为356万hm2,约 占总面积的37 %[32-34]。水土流失严重破坏耕地质量，严重威胁农业可持续发展。长期以来， 大量学者进行多种试验研究，期望能够以保持粮食产量为前提的基础上减少水土流失。其中， 应用聚丙烯酰胺作为堵水剂改良土壤结构，已经广泛应用于农业土壤改良。众多研究[35,36]表 明：聚丙烯酰胺不但能有效地维持土壤团粒体的结构，还能形成新的团聚体，聚丙烯酰胺溶 于水所产生的黏聚作用力可有效地缓解雨水对表面土壤的打击并抑制土壤结皮的形成，使土 壤入渗能力增加，减少地表径流，从而减少水土流失。此外，聚丙烯酰胺还可以改善土壤的
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物理结构，从而影响土壤中养分的迁移。
聚丙烯酰胺可作为保水剂，削弱降水入渗。大量研究表明，应用聚丙烯酰胺作为土壤结 构改良剂，可以增加表层土壤颗粒间凝聚力，以维持良好的土壤结构，防止土壤表层结皮， 使土壤入渗率增加[37]。由于聚丙烯酰胺具有很强的吸水性和保水能力，可同时减少地表径流、 防止土壤流失[38]，并能较好抑制土壤水分蒸发这一水循环的重要环节，从而使干旱半干旱地 区生态环境得到改善。杨永辉[39]等研究发现：当土壤含水量一定时，加如聚丙烯酰胺可抑制 土壤中水分的蒸发。此外，聚丙烯酰胺的亲水基团可吸附水分子，减少水分损耗。经聚丙烯 酰胺处理的土壤水分状况也会发生变化，随着聚丙烯酰胺施用量增加土壤凋萎系数也随之增 加，但增幅不大，土壤中毛细管持水量大幅度增加，使有效水贮量增大[40]，使植物因受水分 胁迫到达萎蔫状态的时间延迟。林文杰[41]等使用德国Stock — hausen公司生产的保水剂对石 楠苗木进行盆栽试验，研究结果表明，施加保水剂延长石楠苗木生存期，并随着土壤中保水 剂用量增加，延长的时间也会增加。
聚丙烯酰胺也是一种有效的土壤结构稳定剂。加入聚丙烯酰胺的土壤能够更好地抵御雨 水的侵蚀，随着加入聚丙烯酰胺量的增加被侵蚀土壤数量随之减少[42]。王辉等经试验发现： 土壤中加入聚丙烯酰胺可减少速效钾、速效磷和硝态氮的流失，减少流失量分别为95 %、95% 和78 %[43]，而且加入聚丙烯酰胺后土壤侵蚀量会降低，因此随土壤流失的养分也会大大减少， 所以利用聚丙烯酰胺来限制营养物质迁移可以在一定程度上减缓水体富营养化的进程。大量 研究发现，聚丙烯酰胺影响土壤中磷和钾迁移的一个主要因素是降雨强度[44]。产生这种差异 主要原因是土壤中加入聚丙烯酰胺后低强度降雨可抑制土壤表层入渗，从而减少表层土壤因 淋溶而失去的养分，但会使表层土壤养分随径流流失量增加；暴雨条件下，土壤中施加的聚 丙烯酰胺可使土壤被侵蚀的可能性降低，减少在雨水侵蚀和地表径流冲刷作用下表层土壤的 流失，同时避免地表径流引起的下层土壤养分流失。此外，土壤中施加聚丙烯酰胺还可影响 坡地土壤水分的再分布，减少土壤水分向深层渗漏，从而降低土壤中养分淋失风险[44]。此外， 聚丙烯酰胺还可作为土壤结构改良剂，可以改变土壤中气体的交流、热量平衡、微生物活动 和植物根系发展，同时还会影响土壤中生物所需养分和水分的储量和供应能力。
因此，应用聚丙烯酰胺提高土壤入渗能力、防治水土流失[45]具有很广阔的前景。
(3)水处理中的应用
由于聚丙烯酰胺具有良好的絮凝性，目前仍是国内外水处理领域中应用最广泛的处理剂 [46]。以聚丙烯酰胺作为有机絮凝剂与活性炭等配合使用，应用在在原水处理中，可提高净水 能力；聚丙烯酰胺也可作为配方药剂应用在工业水处理中；在污水处理中，由于其良好的吸 水性，聚丙烯酰胺可用于污泥脱水；在污水处理中，加入聚丙烯酰胺可增加水回用循环的使 用效率[47]。
(4)在矿业、冶金的应用
聚丙烯酰胺在矿业、冶金工业的主要应用涉及过程为选矿、采矿和冶金[48]。聚丙烯酰胺 可促进回收水中固体物质沉降，使水澄清，同时回收有用固体颗粒物，既可降低水资源的消 耗，又可提高生产效率，减少尾矿流失，降低生产成本，同时避免重工业对环境造成污染；
(5)在纺织业的应用
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聚丙烯酰胺在纺织工业中，常被用作织物的上浆剂和整理剂[49]，可在织物的表面形成保 护层；因其具有良好的吸水性、成膜性和纤维亲和性，可以有效减少纺细纱断线率；同时其 作为后处理剂使用可以阻燃和防止织物的静电；作为印染助剂使用，还可提高产品鲜艳程度； 此外，还可用于纺织印染污水的净化[50]。
(6)在造纸业的应用
聚丙烯酰胺被广泛用于造纸领域中。首先可提高纸张的抗撕扯性和多孔性；其次可以有 效提高填料、细小纤维、颜料等的存留率，并且加快纸张脱水速率，降低原料流失，降低造 纸业对环境的污染；再次可减小纤维絮凝、提高纸张柔和性、均匀性。此外，聚丙烯酰胺还 可应用于造纸业中纸纤维的回收[51]。
(7)其它
聚丙烯酰胺还可以被用于粘合剂、沙漠改良剂、增稠剂、润滑剂、腊纸上腊、电池极间 填浆等。例如，在干电池中加入聚丙烯酰胺，可有效防止电池发霉、变质、漏电，还可缩小 电池体积，增大容量。适用于地质钻井作业中，可使钻头到充分润滑，使其使用寿命延长20% 以上，同时可使钻井速度加快。在养殖业中，可有效改善水质，增加水体透光性，从而改善 水生植物光合作用；在医药业中，可用于废水澄清剂等；在建材业中，可用作涂料增稠分散 剂、陶瓷粘接剂以及锯石板材冷却剂等；在建筑业中，聚丙烯酰胺可用于增强水泥硬度。此 外，聚丙烯酰胺还可作为作天然或合成皮革保护涂层及无机肥料造粒助剂等[52]。
1.2.2.2聚丙烯酿胺的危害
聚丙烯酰胺可应用在许多领域，其最终归属进入环境中，含聚污水不但会改变土壤和水 体的理化性质，而且聚丙烯酰胺本身对水体COD也有一定影响。聚丙烯酰胺的降解性、迁 移转化、地层吸附性及其降解产物对环境的潜在危害也越来越严重。
首先，聚丙烯酰胺在土壤中的行为主要有：挥发、扩散、吸附、解吸、降解、迁移等。 土壤是生态系统中重要组成部分之一，是一个固-液-气-生物构成的多介质复杂体系，是人类 赖以生存和发展的物质基础和环境条件，是污染物吸附、降解等行为发生最为繁杂的场所。 聚丙烯酰胺虽然可以有效减少土壤侵蚀，但其本身进入土壤后提高了土壤的化学需氧量 (COD)，另外由于物理、化学、光化学和生物过程，使聚丙烯酰胺以每年至少10 %的速率 降解，产生的代谢产物具有极强的生物毒性。当土壤中所带与聚丙烯酰胺不同电荷较少时， 单独施用聚丙烯酰胺，不仅会使土壤表面吸附的聚丙烯酰胺量较少，而且使聚丙烯酰胺分子 链变长，长链聚丙烯酰胺分子会堵塞土壤气孔。
其次，使用聚丙烯酰胺在提高石油采收率的同时，大部分含聚丙烯酰胺水溶液进入油层， 致使污水渗透进入地下水层，且使得聚丙烯酰胺在地表和地下水体中长期滞留，导致水环境 受到威胁。
当今，对聚丙烯酰胺驱油的研究已成为各国的研究热点，且三次采油技术也日趋成熟。 然而聚丙烯酰胺产生的危害也日益受到重视[53]。聚丙烯酰胺可以提高油田采收率，但同时我 们逐渐了解到其对地面工程也有相当恶劣的影响[54]，采出水对环境也会造成巨大危害。与普 通水驱污水比较，含聚污水黏度高，对乳化油滴具有稳定作用，会导致生产井及注聚井易被
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腐蚀、结垢，而且地层易堵塞等问题产生。聚丙烯酰胺分子在油滴表面形成的空间位阻碍油 滴接触、聚并，使小油滴更稳定存在于水中。聚丙烯酰胺吸附在油水界面上，使界面膜强度 增大，使破乳更加困难，增加了油水分离的难度，使采出水含油量严重超标[55]。此外在采油 作业中，需配制大量聚丙烯酰胺溶液，进入地层的聚丙烯酰胺会渗入地下水层。由此可以看 出应用的聚丙烯酰胺会同时污染地表、地下水体，聚丙烯酰胺在水体中长期滞留，会对采油 地区水环境造成巨大的危害[56]。
最后，聚丙烯酰胺本身无毒，但在特殊条件下会发生缓慢降解，其降解后产生的丙烯酰 胺（AM)单体[57]毒性很大[58]，国内外已有大量研究者对其毒性进行研究。丙烯酰胺是一种 急性的眼、呼吸道、皮肤刺激物，可通过多种途径进入人体，并引起皮肤过度角质化、湿疹、 脱屑、牛皮癣等[59];另外，丙烯酰胺还可导致人体器官功能受损[60]。高等动物吸收一定量丙 烯酰胺，将导致中枢神经系统受到损伤[60]，甚至发生病变[61,62]，通常以周围神经和脊髓神经 的上行传导束的感觉、运动、自主神经功能受到破坏为标志。在接触丙烯酰胺职业人群的流 行病观察表明，长期接触低剂量丙烯酰胺会出现情绪和记忆改变、嗜睡、震颤和幻觉等症状， 伴随末梢神经病变（出汗、手套样感觉和肌肉无力）[63]。丙烯酰胺已于1959年被美国环保 局归为B类疑似致癌物，有充足动物致癌证据但缺少足够人类致癌证据[64]。动物试验结果表 明，丙烯酰胺能引起基因突变，损伤生物DNA结构，生成新的DNA加合物，还可使染色体 畸变，甚至影响胚胎的发育，并且对内脏等重要器官具有较严重的毒性[65,66]。
对于丙烯酰胺在环境中存在的浓度各国均有相应法律法规：美国职业安全与卫生法 (OSHA)规定职业丙烯酰胺接触标准为空气中丙烯酰胺阈值-时间加权平均值为0.3 mg.m-3 [67];英国规定丙烯酰胺在饮料中含量< 0.25X10-6g.L-1 [68];日本规定排放丙烯酰胺含量<10 X10-6g.L-1;在我国费渭泉等提出，丙烯酰胺排入水体中剩余浓度< 10X10-6g.L-1[69]。
因此，聚丙烯酰胺的降解特性是使用者和环境保护者一直关注和研究的课题。
1.3聚丙烯酰胺在污水中的处理方法
由于聚丙烯酰胺分子量较大且结构稳定，长期以来一直被认为是安全和难于降解的，有 关其在自然界中的降解及其毒理的报道也是在20世纪90年代首先由SmithE[70]提出的。自 然条件下，聚丙烯酰胺会发生缓慢的物理降解（热、机械）[71]、化学降解（水解、氧化以及 催化氧化）[72]和微生物降解[72-74]，在相当长的时间内，聚丙烯酰胺还将被广泛的应用在各个 领域。其毒性亦将逐渐显露出来，并将给生态环境带来不可估量的危害。因此，长期以来寻 找一种高效降解聚丙烯酰胺的方法一直是聚丙烯酰胺使用者和环境保护者研究的课题。到目 前为止，对含聚丙烯酰胺废水处理的手段主要有物理处理法、化学处理法和生物降解法等。
1.3.1物理方法
物理法处理技术即采油中含聚污水的预处理，采油污水在沉降罐中经自然沉降，去除浮 油及大颗粒杂质，经粗粒化后，进行二次沉降并且过滤，除去细小油滴及未沉降的悬浮物。 使用单纯的沉降方法处理含聚污水根本达不到油田回注水的指标，常用处理含聚污水的物理
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方法有机械降解、絮凝沉淀法、热降解、超声技术和激光脉冲技术。
1.3.1.1机械降解
机械降解是应用械能引发的聚合物链反应，破坏其分子机构的过程。研究表明，通过机 械作用即使聚丙烯酰胺粘度降低，其平均分子量也可能几乎不变，这可能因为聚合物的链和 分枝再形成的原因。当钙离子存在于聚丙烯酰胺溶液中时，则能促进其降解。邵振波[75]等发 现在剪切速率到达4 000 s-1前，聚丙烯酰胺分子链只发生轻微降解，在剪切速率达到5 000 s-1 时，聚丙烯酰胺则会发生大幅降解，重均分子量、数均分子量只有母液的1/4左右。
1.3.1.2絮凝沉淀去除法
絮凝沉淀是去除污水中聚丙烯酰胺较常用的方法之一。徐苏欣等[76]对筛选出两种絮凝剂 XN-III和XN-IV进行研究。结果表明，随采污水pH值增加，聚丙烯酰胺的絮凝效果会变差。
1.3.1.3热降解
热降解是指在热作用下使聚丙烯酰胺化学键断裂的过程。室温下，聚丙烯酰胺水溶液比 较稳定，随着温度的升高聚丙烯酰胺就会发生明显的降解现象。实验结果[77]表明，在温度为 50 °C时，随时间增加，聚丙烯酰胺粘度降解率明显下降，而粘度降解率下降的趋势随纬度的 升高而增加。Silva通过对聚丙烯酰胺和聚丙烯酰胺的N取代烷基衍生物的失重曲线进行比 较认为，聚丙烯酰胺在升温过程中共发生了两次降解，其反应温度分别为326 C和410 C， 第一次降解主要是相邻酰胺基相互缩合，脱氨基形成酰亚胺的过程；第二次的降解过程主要 是脱氢、形成二氧化碳，已利用色谱仪分析了降解后的气相组成，并证明产生了氨气[78]。 Yang[79]则进一步根据不同的热重曲线计算出了两次降解过程活化能分别为137.1 kJ.mol-1和 190.6 kJ- mol-1。
1.3.1.4超声波降解
Hsrng — Yuan Yen等[80]运用超声波技术以不同反应温度、照射时间为条件，研究不同浓 度聚丙烯酰胺溶液的讲解情况及粘度降解情况，研究结果表明，超声波对聚丙烯酰胺的降解 效果于温度成正比，与浓度成反比。
1.3.1.5激光脉冲技术
印度的S. P. Vijayalakshmi等[81]运用激光脉冲技术降解聚丙烯酰胺。结果表明，氧气 是使聚丙烯酰胺主链断开的必须条件之一，聚丙烯酰胺降解的第一步为水分子被光激化，产 生羟基，第二步则是聚合物脱氢反应。聚丙烯酰胺的降解程度与激光强度成正比。
1.3.2化学方法
近年来，环境保护者以投入了很大的精力来研究聚丙烯酰胺化学降解特性。化学降解是 指聚合物溶液短期或长期与一些物质接触，聚合物分子结构被该物质破坏的过程。根据降解 机理的不同，化学降解可分为氧化降解、光催化降解和高级氧化降解。
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1.3.2.1氧化降解
聚丙烯酰胺的氧化降解主要是自由基传递反应，其原理是利用强氧化剂或其他能量催化， 产生自由基并引发自由基连锁反应使长链聚丙烯酰胺分子链断裂形成小分子有机物，氧化反 应引起聚丙烯酰胺主链断裂，使其分子量减少，最终被氧化降解成无机物。
氧化降解反应具有自由基连锁反应的特征，在缺氧条件下，易发生分子链偶合，导致链 终结；氧气充足时，易发生氧化降解反应。聚丙烯酰胺溶液中金属离子的含量、种类也可影 响其降解情况，一般认为阴离子不起作用，低价金属离子影响不大，唯有高价金属离子的含 量和种类对聚丙烯酰胺降解影响较大。等离子浓度比条件下降解强度大小顺序为Al3+>Mg2+ >Ca2+>Na+[77]。
多数研究均认为加入过氧化物/还原剂体系作为引发剂，只有在适当配比下，才会使聚丙 烯酰胺降解程度最大化，这是由于如过氧化物过量会使还原剂被氧化，不利于降解反应的进 行。如果溶液中只存在过氧化物，引入微量还原剂，会明显促进降解反应进行。由于聚丙烯 酰胺的商业产品中可能有过氧化物残留，顾此反应不需诱导期，直接生成自由基，通过进一 步自由基传递反应，使聚丙烯酰胺降解。
由于传统氧化降解只能将聚丙烯酰胺降解成小分子有机物，不能明显降低水中COD，且 投资和运行成较高本高，易造成二次污染，因此该方法未能被广泛使用。
1.3.2.2光催化降解
光催化技术能彻底破坏聚丙烯酰胺结构，可在常温、常压下进行，不产生二次污染，且 成本较低，是一种很有发展前途、对环境友好的处理技术[82]
现有研究表明，自然光和紫外线照射均可直接降解聚丙烯酰胺。Smith[83]用不同天然水 配制聚丙烯酰胺溶液，置于封口的玻璃瓶中，经日光照射6周，观察溶液中丙烯酰胺、NH/ 和pH的变化，溶液中丙烯酰胺单体浓度显著增长，NH/浓度下降，未见微生物浓度有明显 改变。可判断降解的主要原因是光照，不是生物降解。光降解聚丙烯酰胺的原理可用键能来 解释：聚丙烯酰胺中C-N、C-H和C-C键的键能分别为414kJ.mol-1、420 kJ.mol-1和 340kJ.mol-1，要断裂这些键所需的光照波长分别为288 nm、250 nm和325 nm。但是由于臭 氧层的存在，波长为286 nm〜300 nm的辐射完全被臭氧吸收，因此日光辐射只能使C-C键 断裂，对C-N和C-H键影响较小。李凡修[84-85]进行了超声光催化降解含聚丙烯酰胺废水技术 的研究。结果表明，该方法可基本上去除水中聚丙烯酰胺，聚丙烯酰胺的去除率可达97.5 %。 光化学法处理难降解有机物具有高效彻底的优点，但其处理成本相对较高，限制其发展空间。
1.3.2.3高级氧化降解
高级氧化技术[90]又称深度氧化技术，其基础时运用氧化剂和催化剂的作用，生成活性极 强的自由基，自由基与有机化合物作用，使水体中的大分子难降解有机物降解成低毒或无毒 的小分子物质。邵强等[86]采用Fenton试剂氧化法对含聚丙烯酰胺污水进行了处理，降解率 能达到近70 °%„Ting Liu等[87]在pH值为6.8条件下，使用固定反应床对浓度为100mg.L-1聚 丙烯酰胺进行催化降解实验，结果表明，聚丙烯酰胺降解率最高可达70 %，降解后溶液中
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几乎不含铁离子。
1.3.3微生物法
生物方法降解聚丙烯酰胺主要是利用微生物特定酶作用，以聚丙烯酰胺为营养源，在菌 株生长和代谢过程中将聚丙烯酰胺降解为小分子有机物和无机物的过程。
由于微生物降解技术较为成熟，且无二次污染和运行成本较低，使微生物降解技术与处 理工艺在各种难降解污染物的无害化处理领域发挥着核心作用。已有研究结果表明，生物降 解聚丙烯酰胺是聚丙烯酰胺的降解过程中的重要方法。由于微生物极强的环境适应性、高繁 殖速率和变异性，使微生物降解与无害化成为解决聚丙烯酰胺引起的环境污染和潜在毒性的 有效手段[1〇]。
1.4微生物降解聚丙烯酰胺 1.4.1微生物降解聚丙烯酰胺机理
微生物降解聚丙烯酰胺的机理主要可分三类。如表1-1所示
表1-1微生物降解聚丙烯酰胺的机理 Tab. 1-1 The mechanism of microbial degradation of polyacrylamide
作用类型 机理
生物物理作用 生物化学作用 酶直接作用
生物细胞生长繁殖使聚合物水解、电离或质子化，发生机械性破坏，分 解成小分子聚合物
微生物对聚合物的分解，产生新物质。
微生物侵蚀使聚合物链断裂或氧化，酶降解机理并非单一，而是复杂的 生物物理、生物化学协同作用，同时伴有相互促进的物理、化学过程。
生物降解是一种复杂的生物物化作用过程。菌种一般有两种来源：一种是从环境中直接 获取；另一种是通过细胞驯化培养筛选出对聚丙烯酰胺具有良好降解能力的菌种。作用过程 为[88,89]:微生物刚处于含聚丙烯酰胺环境时需经过一个适应过程，然后，微生物为获得生存 所需碳或氮源，在基因控制下产生可降解聚丙烯酰胺的生物酶。微生物释放的脱氨酶可断开 分子的C一N键，解离出NH2-，一CO+与羟基结合形成羧基。另外，在有氧存在下的条件下， 微生物释放的酶能够使聚丙烯酰胺主链末端的一CH3逐渐断开，并被其他酶分解。在多种微 生物酶、氧及胞外物质的参与下，聚丙烯酰胺大分子链被逐步降解，最终被降解成CH4、CO2 和H2O等，而降解出来的中间产物NH2-小分子有机物则被微生物作为氮源和碳源利用。
在微生物酶和胞外物质联合作用下，聚丙烯酰胺的分子结构被破坏，长链大分子裂解成 短链小分子，再进一步分解成微生物所需的营养源，最终使聚丙烯酰胺溶液黏度下降；另外，
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在微生物的作用下，聚丙烯酰胺分子侧链上的酰胺基被氧化成羧基，使降解后的聚丙烯酰胺 溶液体系酸度增加[89’90]。
1.4.2研究进展
过去一般认为聚丙烯酰胺对微生物具有毒性，有关降解聚丙烯酰胺生物生物降解的研究 国内外都很少出现在公开文献报道中。早期Magdalmmk等[91]一些研究者曾提出聚丙烯酰胺 不可生物降解。但近年来的研究表明，微生物可利用或合成酶类、非蛋白质类和胞外其他物 质等物质，来分解聚丙烯酰胺，为微生物生长和繁殖提供原料及能量。
但后来有人提出，在以聚丙烯酰胺作为土壤中生活的微生物基质的试验表明，微生物只 能利用聚丙烯酰胺作为唯一的氮源，不能作为唯一碳源被。
H. M. Abdelmagid等[92]首次提出聚丙烯酰胺可被生物降解，研究表明，将聚丙烯酰胺投 入含有某些细菌的土壤中，无机氮的浓度增加，研究认为细菌释放的酰胺酶可使聚丙烯酰胺 发生降解，同时产生大量无机氮。
据报道，微生物降解驱油用聚丙烯酰胺作用的微生物主要有硫酸盐还原菌、产碱假单胞 菌、腐生菌、梭状芽孢杆菌等[93]。
在国内，最早于1999年黄峰等研究了硫酸盐还原菌对聚丙烯酰胺的降解[94]。由于油田 中聚合物驱的大范围使用及含聚污水的逐年增加，使国内研究者对含聚丙烯酰胺污水的处理 研究逐渐增多。
黄峰等[95]以中原油田现场取样的腐生菌（TGB)聚丙烯酰胺溶液中培养24h。实验表明， 培养7天后腐生菌（TGB)是聚丙烯酰胺溶液粘度损失率小于12 %，说明腐生菌（TGB)对 聚丙烯酰胺的生物降解较缓慢。研究表明，菌体接菌量的大小、溶液的pH值及菌种活化次 数都会对聚丙烯酰胺的降解产生影响。硫酸盐还原菌（SRB) [96]菌量达到3.6X104 mL-1时， 与30 °C培养7 d，使1 000 mg.L-1聚丙烯酰胺溶液粘度损失率达19.6 %，但随后聚丙烯酰胺 粘度损失率不会随培养时间的增加而增加。
孙晓君[97’ 98]等以葡萄糖好氧颗粒污泥菌源模拟含聚丙烯酰胺废水降解特性，研究表明， 污泥中含有丰富的微生物并且有良好的微生物协同作用，对聚丙烯酰胺降解效果较好。培养 6 d，模拟含聚丙烯酰胺废水降解，聚丙烯酰胺降解率可达40 %以上。经驯化后颗粒污泥形 态变化显著，粒径大约减小50 %，同时污泥颜色改变说明颗粒污泥中优势菌落发生了演替。
张英筠等[99]从被聚丙烯酰胺污染的土壤和水样中筛选出生长良好菌种3株，复配制成 菌悬液，然后将降解菌按10 %比例接入10 000 mg.L-1和5 000 mg.L-1的聚丙烯酰胺溶液中。 结果表明，该降解菌在高浓度聚丙烯酰胺溶液中最适合生长浓度为1 000〜10 000 mg.L-1，并 对10 000 mg.L-1聚丙烯酰胺溶液有良好的降解效果。
李宜强等[100]将油田含聚丙烯酰胺出水中筛选，得到由3株兼性菌组成的能以聚丙烯酰 胺作为碳源和氮源生长的混合菌，属于假单胞菌和梭状芽孢杆菌属。研究表明，混合菌可在 45 C下降解聚丙烯酰胺，且聚丙烯酰胺溶液粘度明显降低。
夏彦渊等[101]从油田驱油污水中分离出7株有明显降解效果的细菌，确定适合微生物降解
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聚丙烯酰胺的最优条件，为以石油为基础培养基碳源，以NH4H2PO4为氮源，培养8 d溶液 粘度降到最低值，此后粘度基本不变，粘度降解率可达32.6 %。
赵敏等[102]利用Hungate厌氧技术，从含聚丙烯酰胺驱污水中分离出筛选出一株聚丙烯 酰胺降解菌，经鉴定为肠杆菌属。可以聚丙烯酰胺作为唯一碳源生长，将接菌后浓度为1000 mg-L-1的聚丙烯酰胺培养基，培养10 d，其降解率为24 %，且粘度下降40 %。
包木太等[103]筛选出一株降解菌，经过驯化后，筛选得到的降解菌株明显适应了聚丙烯酰 胺环境，并可以在一定程度上降解聚丙烯酰胺。实验结果表明：在聚丙烯酰胺溶液浓度为500 mg.L-1、pH值为7.5、温度为35 °C的条件下，降解率最高可达到38.4 %。降解后，产生小 分子碎片，并对环境无害的物质。
高玉格等[104]从南阳采油厂含聚丙烯酰胺的污水和配聚罐底泥中筛选出1组（共17株） 能在高矿化度下生长的混合菌群（由芽孢杆菌、黄杆菌属、节细菌属等组成），该混合菌群联 合作用可降解部分水解聚丙烯酰胺和石油中的大分子烃类，从而获得微生物新陈代谢所需的 碳源。在一定条件下培养一定时间，聚丙烯酰胺降解率及COD去除率均可达50 %以上。
郝春雷[105]等从大庆油田筛选4株聚丙烯酰胺降解菌种，复配组成复合菌并配置菌悬液进 行试验。结果表明，在37〜45 C，pH 6.4〜8.0时，复合菌对聚丙烯酰胺有较强的降解能力。
包木太等[106]从胜利油田活性污泥中分离筛选出1株降解效果较好的菌AS-2。试验结果 表明，当培养时间为5 d、pH为8、温度为40 C、原油为碳源、NaN〇3为氮源、浓度分别 为2.5、1.4 g-L-1时，聚丙烯酰胺降解率达到45.23 %。
陈庆国等[107]筛选出三株可降解聚丙烯酰胺得好氧菌种，命名为PM-2、PM-3、PM-4。 连续活化4次，将三株菌混合正交培养，优化出PM-2与PM-3混合菌降解效果最好。降解 条件为降解时间为3d，接种量为体积比3 %，适宜温度为温度为35〜45 C，适宜pH值为 6.0〜6.5，摇床振荡速度为140r-min-1，矿化度2 500〜10 000 mg-L-1。浓度为300mg-L-1的聚 丙烯酰胺溶液降解率可达到42 %。
常帆等将[108]筛选出枯草芽孢杆菌FA16和假单胞菌CJ419。将FA16接种到废水样品中， 对数期持续6 d，11 d达到稳定期，聚丙烯酰胺降解率最大可达25 %。CJ419于30C条件下 培养，6 d达到稳定期，对聚丙烯酰胺的降解率最大可达30.4 %。2株菌联合降解，5 d降解 率达到 35.6 %。
在国外，Suzuki等[109]对聚丙烯酰胺降解的研究大都集中在能否被降解及是被微生物作 为碳源还是作为氮源利用这几个方面。多数研究者认为聚丙烯酰胺不能被微生物完全降解， 只能部分降解，即使被氧化或光降解形成的小分子量聚丙烯酰胺也具有很强的生物抗性。
M. M. Grula等[110]研究了土壤聚丙烯酰胺降解细菌与特定聚丙烯酰胺的相互作用，发现 该菌可根据土壤中植物的不同生长情况释放出具有短暂活性的酰胺酶，促使CiN键断裂， 提供氮源。
Kay-Shoemake等人[111]从土壤中筛选出微生物只能作唯一氮源被微，但是不能作为唯一 碳源，原因可能是聚丙烯酰胺先被转化为长链聚丙烯酸酯，聚丙烯酸酯可被微生物作为氮源 利用。
S.Magdaliniuk等[112]曾研究微生物对蒙脱石/聚丙烯酰胺悬浮液的影响，发现悬浮液浓度
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和黏度没有变化，因此他认为聚丙烯酰胺不可被生物降解。但近年来，很多研究者筛选培养 出多种在特定条件下可降解聚丙烯酰胺的微生物，至今，大多数学者已经接受聚丙烯酰胺可 被生物降解的观点。
为研究特定的细菌对聚丙烯酰胺降解作用，N. Kumchika等[113]从活性污泥中分离筛选出 多株能降解水溶性聚丙烯酰胺的菌株。在无外加碳氮源的情况下，该菌株仍能生长繁殖，且 聚丙烯酰胺溶液的黏度降低，相对分子质量降至原来的1/4,培养基pH也从6.8降至5.8。 用核磁共振分析结果显示，聚丙烯酰胺侧链的断裂数量较多，主链也存在一定程度断裂，所 以他认为该菌株能以降解聚丙烯酰胺来获取生长繁殖所需的碳氮源。
G. R. J. Sutherland等[114]研究发现，当培养条件不同时，白腐真菌对聚丙烯酰胺的降解 情况也不同。当外界氮源充足时，聚丙烯酰胺浓度没有显著变化，而不再外加氮源后，聚丙 烯酰胺降解速度提高了 1倍左右，结果表明缺少氮源时白腐真菌可降解聚丙烯酰胺并从中获 取氮源。
Jeanine L.Kay-Shoemake等[115，116]从土壤中筛选出微生物，以聚丙烯酰胺作为生长基质， 实验中发现：聚丙烯酰胺能作为唯一氮源，但不能作为唯一碳源被微生物降解，温度为30°C 条件下培养7 d后，1 000 mg.L-1的聚丙烯酰胺溶液黏度降低19.6 %。
现有关于聚丙烯酰胺生物降解的研究中，一般认为在好氧条件下，微生物可利用聚丙烯 酰胺中的酰胺基作为氮源，形成丙烯酸残体并放出氨气；但是关于聚丙烯酰胺作为微生物唯 一碳源的报道却很少，并且存在着一定的争议，作为碳源利用非常困难除了由于其大分子难 于被微生物摄入到细胞体内并且进行降解外，即使在小分子量的情况下，其抗生物降解能力 仍然很强。
Schumann and Kunst[117]用14C标记阴离子和阳离子聚丙烯酰胺在活性污泥中降解作用， 研究表明两种聚丙烯酰胺都没有被显著降解（小于2 %)，在厌氧环境中也得到类似的结论。
C. A.Seybold等[123]指出聚丙烯酰胺降解过程受多种因素影响，微生物可将其作为唯一碳 源，但不能将其降解成单体。
张英筠[119]研究表明，聚丙烯酰胺溶液中菌体含量随浓度升高而减少，当浓度小于12000 mg.L-1时生长很旺盛，当浓度大于20 000 mg.L-1时，菌种几乎不能生长，由微生物生长动力 学可知，底物浓度过高或过低，都会抑制微生物生长，因此当聚丙烯酰胺浓度范围在1 000〜 10 000 mg.L-1内，菌种可以将聚丙烯酰胺作为碳源而生长。
魏利[120]利用厌氧技术，从大庆油田石油采出液中分离筛选出一株聚丙烯酰胺降解菌A9。 该菌株可将聚丙烯酰胺分子链上的酰胺键水解成羧基，将大分子聚丙烯酰胺降解为小分子质 量的化合物，通过扫描电镜和红外光谱分析结果表明：菌株可以聚丙烯酰胺为唯一碳源。降 解后聚丙烯酰胺表面结构发生变化，部分官能团改变。聚丙烯酰胺初始浓度为500 mg.L-1， 培养20 d时，生物降解率为61.2 %，并且溶液粘度显著下降。
1.4.3复合菌优势
随着生产过程中各种化学添加剂的广泛使用，大量有毒有害难于降解的物质进入环境中，
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使微生物生长环境变得越来越复杂的同时，对菌株生长繁殖也产生了极大危害。
在研究微生物对某种大分子有机物聚合物降解过程时，一般实验室研究中首先会对单一 菌株降解聚合物的过程进行监控，这是由于单一菌株降解条件易于控制，结果清晰且重复性 好。但单以菌株降解效果一直不理想。随着化学添加剂的广泛应用，大量有毒有害物质进入 环境，而这些物质往往会对微生物降解表现出较强的抵抗作用，其主要原因是单一微生物不 具备单独降解这些化合物的能力需要多种微生物或多个群落协同作用。因此在降解聚丙 烯酰胺的研究中，我们可以利用微生物种群间的协同作用来增强降解效果[122]。
常帆等[123]研究了假单胞菌和枯草芽孢杆菌联合使用时对油田采出水中聚丙烯酰胺的降 解作用，认为微生物产生降解酶和胞外物质发挥作用使聚丙烯酰胺发生被降解。结果显示， 两种菌联合培养25 d后溶液降黏率可达80.3 %，远远高于单独使用枯草芽孢杆菌（25 %) 和假单胞菌（30.4%)，表明两株菌的协同作用可提高污水样品中聚丙烯酰胺降解率。
董春娟等[121]研究认为微生物群落可以通过协同作用、共代谢和转移中间产物来达生物降 解作用。在协同作用中，单菌种无法合成完整的酶系统来降解那些难降解物质，而微生物群 落中不同的基因拥有者可产生不同的酶，从而降解难降解物质。对于难降解物质，有些能被 单纯厌氧微生物降解；有些则需经厌氧水解提高污染物生物可降解性后，才能被好氧微生物 最终降解；而有些则需在同一体系中经历一系列好氧、厌氧过程才能被降解。
佘跃惠等[124]将7株聚丙烯酰胺降解菌混合在一起，研究由混合菌对聚丙烯酰胺的降解情 况和对含聚丙烯酰胺废水的处理情况，结果表明，混合菌可提高降解效果，微生物可不以聚 丙烯酰胺为碳源，但可引起聚丙烯酰胺降解，可能是由于微生物的群落效应，当存在合适底 物时，群落中一些微生物以这些底物为营养源生长繁殖，其代谢产物或产生的某些酶会与聚 丙烯酰胺发生相互作用，导致聚丙烯酰胺水解或断链，而这些产物又被其他微生物利用，使 聚丙烯酰胺降解。
微生物降解作为对环境有好、且处理彻底，可进行原位异位修复，处理工艺已经应用在 多种领域发。由于微生物数量巨大、种类繁多、代谢活动旺盛和代谢类型多样等特点，使在 物质转化中发挥了重要作用。目前，分子生物技术和基因工程速发展，为微生物发展提供了 有效的技术支持，是的微生物技术必将成为解决聚丙烯酰胺在环境中危害的重要手段。
1.5研究内容
(1)聚丙烯酰胺降解细菌的筛选
采用平板胁迫的方法，从大庆市生产聚丙烯酰胺化工厂厂区土壤和排水沟泥水中筛选出 以聚丙烯酰胺为唯一氮源生长的细菌，根据各个被筛选出的细菌对聚丙烯酰胺的降解能力， 确定聚优势降解细菌。
(2)聚丙烯酰胺降解细菌的鉴定
参照《常见细菌系统鉴定手册》[125]观察菌落特征、生理生化特性及16S rRNA法对聚丙 烯酰胺优势降解菌进行鉴定。
(3)优势降解菌以聚丙烯酰胺为唯一碳源、唯一碳氮源生长情况
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将筛选出的优势降解细菌接到以聚丙烯酰胺作唯一碳源、唯一碳氮源的固体基础培养基 上培养，观察优势降解菌是否生长。确定并比较降解情况和菌体生长情况。
(4)优势降解菌及复合菌的生长及降解特性
能够影响微生物生长、繁殖的环境因素有很多，本研究按照单因素控制的方法，重点考 察了聚丙烯酰胺底物浓度、底物pH值、培养温度3大因素对优势降解菌及复合菌生长和聚 丙烯酰胺降解情况的影响，并确定最佳生长及降解条件。
(5)不同碳氮源度复合菌降解聚丙烯酰胺的影响
外加少量碳源和氮源可促进微生物的生长和代谢作用，或导致种间竞争，从而抑制微生 物的生长和代谢作用。本试研究加入少量有机或无机碳氮源，研究不同碳氮源对复合菌降解 聚丙烯酰胺的影响。
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2材料与方法 2.1试验材料 2.1.1聚丙烯酰胺原药
聚丙烯酰胺MW，相对分子量1 000万，由国药集团化学试剂有限公司生产，批号F20110937。
2.1.2供试土样和水样
筛选降解菌的土样：取自大庆市生产聚丙烯酰胺的化工厂厂区土壤和排水沟泥水。
2.1.3试验培养基
试验用培养基见表2-1。
表2-1试验用培养基
Tab. 2-1 Culture medium used in the experiment
培养基名称用途培养基成分
蔗糖30 gFe2(S〇4)3 0.03 g
NaCl 0.5 gK2HP〇4*3H2〇1.6 g
基础培养液 (基）筛选降解细菌KH2P〇4*3H2〇0.4 g MgS〇4*7H2〇 0.06 gCaCl2 0.01 g ZnS〇40.05 mg
CuS〇4 0.05 mg蒸馏水1 000 mL
(琼脂15〜20 g)
牛肉膏培养基降解细菌富集 菌落形态观察牛肉膏3 g 氯化钠5 g (琼脂15〜20 g)蛋白胨10g， 蒸馏水1 000 mL
蛋白胨10 gNaCl 5 g
葡萄糖10g蒸馏水1 000 mL
葡萄糖发酵 基础培养液生理生化试验pH调至7.4
1 000 mL培养液加入1.6 %溴甲酚紫或溴麝蓝1 mL， 混匀后使培养基呈蓝色。常规灭菌后使用前以无菌操 作定量加入灭菌的浓糖液(浓度为20%)。
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15 表2-1试验用培养基
Tab. 2-1 Culture medium used in the experiment
培养基名称 明胶柱体穿刺法 培养基
培养基成分
蛋白胨1〇g 明胶120 g
用途
生理生化试验 牛肉膏5 g NaCl 5 g
蒸馏水 1 000 mL
硫化氢产生试验生理生化试验 蛋白胨 20 g
培养基琼脂15 g
硫代硫酸钠0.6 g
调节pH 7.2
柠檬酸铁铵0.5 g NaCl 6 g 蒸馏水1 000 mL
蛋白胨 5 g葡萄糖5g
NaCl 5 g蒸馏水 1 000 mL
pH 值 7.0〜7.2
胰蛋白胨10 g蒸馏水 1 000 mL
pH值调至7.2〜7.6
蛋白胨5 g葡萄糖 5 g
K2HPO4 5 g蒸馏水 1 000 mL
可溶性淀粉2g牛肉膏3 g
蛋白胨 5 g蒸馏水 1 000 mL
pH值调至7.2〜7.4
蛋白胨5 g蒸馏水 1 000 mL
pH值调至7.2
牛肉膏 3g 蛋白胨 5 g
NaNO3 1 g蒸馏水 1 000 mL
pH值调至7.2〜7.4
甲基红试验 培养基生理生化试验
吲哚试验培养基生理生化试验
V.P试验培养液生理生化试验
淀粉水解试验培
养基生理生化试验
产氨试验培养液生理生化试验
硝酸盐还原试验 培养液生理生化试验
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2.1.4试验仪器与药品
主要药品为1)蔗糖、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钠、饱和溴水、碘化镉、水合硫酸铝、 重铬酸钾、过硫酸钾、硫酸铝钾、冰乙酸、硫酸银和抗坏血酸等均为分析纯；2)蛋白胨和牛 肉膏为生化试剂。
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表2-2试验用仪器
Tab. 2-2 Instrument used in the experiment
名称型号生产厂家
单人单面净化工作台SW-CJ-1FD苏净集团苏州安泰空气技术有限公司
生化培养箱HPS-280哈尔滨东联电子技术开发有限公司
手提式压力蒸汽灭菌器YMSII-280B宁波市镇海金鑫医疗器械有限公司
空气浴振荡器HZQ-C哈尔滨市东联电子技术开发有限公司
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电热鼓风干燥箱DHG-9240A上海一恒科学仪器有限公司
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离心机TDL-60B-B湖南星科科学仪器有限公司
2.2试验方法
2.2.1菌株的分离和富集
实验样品采自大庆市生产聚丙烯酰胺的化工厂厂区土壤和排水沟泥水，置于4 °C恒温保 存。将采集污染土样称取3 g,投入100 mL无菌蒸馏水中，在30 °C下至于摇床中振荡（转 速120 rmin-1)转培养3 h后，稀释至10-1、10-2、10-3和10-4。将5个稀释度的悬浊液分别滴 加1滴于以聚丙烯酰胺作为唯一氮源的基础培养基（聚丙烯酰胺浓度为100 mg.L-1)中，每 个稀释度作3个平行，培养5 d。
待平板长出菌落，选择生长状况良好且有明显性状差异的细菌菌落，于牛肉膏固体培养 基中划线纯化，并将分离纯化后菌株接入牛肉膏斜面培基中培养2d，长出菌落后，于4 C 保存。
2.2.2聚丙烯酰胺降解细菌的筛选
采用平板胁迫法驯化降解菌，基础培养基灭菌后，在无菌条件下加入一定量聚丙烯酰胺， 逐级添加聚丙烯酰胺，使其浓度分别为100 mg.L-1、200 mg.L-1、300 mg.L-1、500 mg.L-1、 700 mg.L-1和1 000 mg.L-1。将分离出的菌株接种到加入基础培养基的平板上，于30 C下培
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养5 d,每个浓度3次平行试验。挑选生长速度快长势好的细菌，接入牛肉膏斜面培培基中 培养2d，4°C保存备用。
将保存备用的各菌株接入已灭菌的牛肉膏液体培养基中，在30 °C下于摇床中振荡（转 速120 rmin-1)培养2d。每株菌3个平行，取牛肉膏液体培养基在无菌条件下4 000 rmin-1 离心20 min。取下层菌体溶于无菌蒸馏水中，制成菌悬液。测其600 nm波长下的OD值， 使OD600为1.000左右，作为接种液，于4 C下保存备用。
在无菌条件下，将灭菌后的基础培养基中加入聚丙烯酰胺，使其浓度为500 mg.L-1。按 照2%的体积比加入菌悬液，同时作不加菌悬液的对照实验，在30 C下于摇床中振荡（转 速120 rmin-1)培养10 d，其后取出试验样品稀释，用淀粉-碘化镉分光光度法测其吸光度， 以蒸馏水作空白试验，计算降解率，依据降解率的大小，筛选出优势降解细菌。
2.2.3菌株生长及降解性能的评价
2.2.3.1菌体生长量
以样品的OD600值作为菌体生长量的指标。
2 2 3 2聚丙烯酰胺的降解率
采用淀粉-碘化镉分光光度方法测定聚丙烯酰胺的含量。
生物降解率ni (%)的表达式为：
C - C
rt, = 0^ x 100(式 3-1)
C。
式中：C0 ——降解前的聚丙烯酰胺含量，mg.L-1;
C,——降解后的聚丙烯酰胺含量，mg.L-1。
2.2.4聚丙烯酰胺优势降解细菌的鉴定
2.2.4.1菌落形态观察
用以灭菌枪头吸取各优势降解菌菌悬液1 mL分别滴在牛肉膏培养基平板上，每1菌株3 次重复，置30 C培养箱中1〜3d，每天观察菌落特征。
2.2.4.2菌体形态观察
用扫描电镜观察细菌菌体形态，方法如下：
取样：菌种在牛肉膏培养基平板上培养成3d，刮下菌体；
固定：用2.5 %戊二醛固定，置于4 C的冰箱中固定1.5 h;
冲洗：用0.1 mol.L-1、pH值6.8的磷酸缓冲溶液冲洗，10 min后离心10 min取下层菌体; 脱水：分别用浓度为50 %、70%、80 %和90 %的乙醇脱水依次各一次，每次10 min后 离心10 min取下层菌体，用100 °%乙醇脱水，10〜15 min后离心10 min取下层菌体；
18
置换：叔丁醇：100 %乙醇=1: 1，纯叔丁醇各一次，每次15 min后离心10 min取下层
菌体；
用ES-2030 (HITACHI)型冷冻干燥仪干燥处理后的样品，约4 h，其后将样品贴在扫描
电镜样品台上，进行真空镀金，最后在扫描电子显微镜下观察菌体形态特征。
2.2.4.3生理生化实验
本实验参照《常见细菌系统鉴定手册》[125]对以选出的菌株进行生理生化性质测定。鉴定 方法主要有革兰氏染色法、V-P实验、葡萄糖产酸试验、葡萄糖产气试验、接触酶试验、甲 基红试验、明胶液化、细菌的运动性观察、硫化氢反应等。
(1)革兰氏染色试验
挑取少量菌苔，涂布于载玻片上，风干，在火焰上固定，滴加结晶紫染色1〜2 min，水 洗，滴加碘液冲去残水，使碘液覆盖约1 min，水洗。滤纸吸去载玻片上的残水，在白色背 景下，95 %的乙醇脱色，至流出乙醇无紫色，水洗。用番红液复染约2min，水洗。干燥后， 用油镜观察。菌体被染成蓝紫色为革兰氏阳性菌，被染成红色为革兰氏阴性菌。
(2)葡萄糖产酸、产气试验
接种：在无菌条件下用接种环沾取少量菌种，分别接种于葡萄糖发酵液试管中。另取葡 萄糖发酵1支，不接种任何菌作为对照。
培养：放入30 °C恒温培养箱中培养3d。
观察结果：与对照管比较，若培养液变黄，则结果为阳性，表明该菌能分解葡萄糖产酸; 若接种液颜色不变，结果为阴性，表明该菌不利用葡萄糖；若培养液中的小管内有气泡为阳 性反应，表明该菌分解糖能产酸并产气；如小管内没有气泡为阴性反应。
(3)吲哚试验
接种：在无菌条件下用接种环沾取少量菌种于蛋白胨液体培养基中，以不接种作对照。 培养：放入30 C恒温箱中培养3d。
观察结果：取出试管，沿试管壁加入对二甲基氨基苯甲醛试剂（对二甲基氨基苯甲醛5.0g， 戊醇75 mL，浓盐酸25 mL) 5〜10滴于液面上，在液层界面发生玫瑰红色者为阳性反应， 仍为黄色者为阴性。
(4)硫化氢产生试验
接种：在无菌条件下将菌种穿刺接种于培养基中。
培养：放入30 C恒温箱中培养5 d。
观察结果：如穿刺线上或试管底部变黑者为阳性反应。
(5)明胶液化试验
19
接种：在无菌条件下将菌种穿刺接种于培养基中，以不接种作为对照。
培养：放入20 °C恒温培养箱中培养10 d。
观察结果：在20 °C以下温室中观察细菌生长情况和是否液化。若菌已生长且明胶表面 无凹陷为稳定凝块，则为明胶水解阴性；如果明胶部分或全部变为可流动的液体，则表示明 胶水解阳性；如细菌生长，明胶未液化，但表面出现凹陷小窝，表示轻度水解，按阳性记录。
(6)氧化酶试验
在干净的培养皿里放一张滤纸，滴加1 %的二甲基对苯撑二胺水溶液，仅使滤纸湿润即 可。
接种：用白金丝接种环（不可用镍铬丝）沾取18〜24 h菌龄的菌体，涂抹在湿滤纸上。 观察结果：在10 s内菌体呈现红色者为阳性，60s后出现红色者按阴性处理。
(7)过氧化氢酶试验
接种：用铂丝接种环挑取已培养18〜24 h菌种涂沫于滴有3 %〜5 %过氧化氢的干净的 载玻片。
观察结果：若有出现气泡，则为过氧化氢酶阳性反应，无气泡者则为阴性。
(8)硝酸盐还原试验
接种：在无菌条件下用接种环沾取少量菌种于硝酸盐液体培养基中，以不接种作对照。 培养：30 C恒温培养箱内培养3d。
取2支试管倒入少许培养后的培养液，在其中分别滴1滴A液（称取磺胺酸0.5 g，溶于 150 mL 3 %醋酸溶液中，保存在棕色瓶中）和B液（a -萘胺0.5 g，溶于50 mL蒸馏水中， 煮沸，慢慢加入30 %醋酸溶液150 mL，保存在棕色瓶内），在对照管中同样加入A液，B液
各1滴。
观察结果：如培养液变为棕色、橙色、玫瑰红色、粉红色，表示有亚硝酸盐存在，为阳 性。如无红色出现，可加1、2滴二苯胺试剂（二苯胺0.5 g溶于100mL浓硫酸中，用20mL 蒸馏水稀释），如呈蓝色反应，表示培养基中有硝酸盐，如无蓝色出现，表示硝酸盐和新形成 的亚硝酸盐已还原成其他物质，仍表示硝酸盐还原为阳性。
(9)甲基红试验（M. R试验）
接种：在无菌条件下用接种环接种少量菌体，于葡萄糖蛋白胨培养液试管中。
培养：30 C恒温箱中培养3d。
观察结果：振摇试管3 min，然后加入3〜4滴甲基红试剂，若出现红色为甲基红试验 阳性反应，黄色为阴性反应。
(10)微生物对淀粉的水解
制平板：将已融化并冷却至50 C左右含淀粉的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，到入无菌培
20
养皿中，静置冷凝。
接种：在无菌条件下用接种环沾取少量菌株，点种于平板上。
培养：30 °C恒温培养箱中培养3d。
观察结果：形成明显菌落后，在平板上滴加路戈氏碘液（碘1.0 g，碘化钾2.0 g，蒸馏 水300 mL)，如淀粉水解，则在菌落周围有不变色透明圈，表示淀粉水解为阳性。若仍为蓝 黑色，则表示淀粉水解为阴性。
(11)产氨试验
接种：在无菌条件下用接种环沾取少量菌株。
培养：30 C恒温培养箱中培养3d。
观察结果：取少许培养液，加入Nessler试剂（将20 g碘化钾溶于50 mL水中，并在此 溶液中加碘化汞小粒至溶液饱和为止，此后再加460 mL水和134 g氢氧化钾，将上清液贮于 暗色瓶中备用）数滴，出现黄褐色沉淀为阳性。
(12)乙酰甲基甲醇试验（V.P试验)
接种：在无菌条件下将菌株接于葡萄糖蛋白胨培养液试管中。
培养：放入30 C恒温培养箱中培养3d。
观察结果：将摇动试管5 min，取培养液和等体积40 %KOH相混。加少许6 %a-萘酚纯 酒精溶液，继续振荡，放入30 C恒温培养箱内保温15〜30 min，若出现红色，即为V.P试 验阳性反应。
2.2.4.4优势降解菌16S rRNA序列的测定及系统发育树的分析
此过程由上海生工生物工程技术服务有限公司完成，采用16S rRNA序列测定法对细菌 菌株的DNA进行提取、扩增以及序列测定。将所得测序结果上传至美国基因数据库 (GenBank)，与基因数据库比对，并对获得的同源序列进行序列分析，选择相似度较高的菌 株作为参比菌株。将DNA序列导入Mega 4.0软件建系统发育树。
2.2.5聚丙烯酰胺含量的测定
采用淀粉-碘化镉分光光度法测定聚丙烯酰胺的浓度，在100 mL的烧杯中，加入准确称 取0.1000 g的聚丙烯酰胺，溶于大约30 mL的蒸馏水，待全部溶解后，转移至100 mL的 容量瓶中，多次用蒸馏水冲洗烧杯，将冲洗过的蒸馏水转移至容量瓶中，将容量瓶内加水至 刻度，摇匀，充分溶解。
然后用蒸馏水将1 000 mg_L-1聚丙烯酰胺溶液分别稀释成10、20、30、40、50、60、70、 80、90 和 100 mg-L-1 各 50 mL。
加入5.0 mL的醋酸氨缓冲溶液于50 mL容量瓶中，加入2.0 mL以配置好的聚合物溶液， 加入20 mL蒸馏水混匀，其后加入2.0 mL饱和溴水，静置10 min溶液为黄色，加入5.0 mL
1 %甲酸钠溶液，待溶液褪色后摇匀，静置5 min，至颜色完全褪去，加入5.0 mL淀粉-碘化
21
镉溶液，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，静置10 mm后，用分光光度计以580 nm波长处测定 溶液的吸光度，以不加聚丙烯酰胺做空白样作参比。绘制聚丙烯酰胺浓度与吸光度之间的标 准曲线及方程[126]。
2.2.6优势降解菌以聚丙烯酰胺为唯一碳源或碳氮源的生长情况
把分离所得的优势降解菌分别接菌在含聚丙烯酰胺500 mg.L-1去除蔗糖加入NH4CI和去 除蔗糖不加NH4CI的基础培养基平板上，30 °C培养7 d，观察降解菌是否能够以聚丙烯酰胺 为唯一碳源和唯一碳氮源进行生长。
向除去蔗糖加入NH4CI和向除去蔗糖不加NH4CI的基础培养液中加入聚丙烯酰胺，使其 浓度为500 mg.L-1，按照2 %体积比菌悬液，摇床培养10 d，测定菌体生长量和聚丙烯酰胺 的浓度，计算其降解率。
2.2.7聚丙烯酰胺优势降解菌生长和降解特性
2.2.7.1聚丙烯酿胺优势降解菌的生长曲线和降解率曲线
向已灭菌的基础培养液中加入聚丙烯酰胺，使聚丙烯酰胺浓度为500 mg.L-1，接入体积 比2 %的各菌悬液，于30 C、120 r.mm-1在摇床中培养，每个处理设3次重复，每天取样测 定菌体的生长量和聚丙烯酰胺浓度，共培养10d，绘制聚丙烯酰胺降解率的曲线和降解菌的 生长曲线，并依降解曲线确定后续试验适宜时间。
2.2.7.2底物浓度对优势降解菌生长和降解特性的影响
向已灭菌的基础培养液中加入聚丙烯酰胺，使聚丙烯酰胺浓度分别为50、100、200、300、 500、700、1 000和1 500 mg-L-1，接入体积比2 %的各菌悬液，于30 C、120 r-min-1在摇
床中培养，每个处理设3次重复，按上述确定的适宜时间培养，取样测定菌体生长量和聚丙 烯酰胺的浓度，依据其大小确定菌株适宜聚丙烯酰胺的底物浓度范围及最适底物浓度。
2.2.7.3培养温度对优势降解菌生长和降解特性的影响
向已灭菌的基础培养液中加入聚丙烯酰胺，使其浓度为最适底物浓度，接入体积比2 % 的各菌悬液培养，设置培养温度分别为15 C、25 C、30 C、35 C、40 C和45 C，于 120 rmm-1在摇床中按确定的适宜时间进行培养，每个处理设3次重复，取样测定菌体生长 量和聚丙烯酰胺的浓度，依据其大小确定菌株适宜温度范围及最适温度。
2.2.7.4初始pH值对优势降解菌生长和降解特性的影响
向已灭菌的基础培养液中加入聚丙烯酰胺，使其浓度为最适底物浓度，用已灭菌的1 mol.L-1氢氧化钠或1 mol.L-1盐酸调整基础培养液的初始pH值，使培养液的pH值分别为3、 4、5、6、7、8、9、10、11和12，接入体积比2 %的各菌悬液培养，于上述确定的适宜温度 和120 rmm-1在摇床中培养，按确定的适宜时间取样，每个处理设3次重复，测定菌体生长
22
量和聚丙烯酰胺的浓度，依据其大小确定菌株适宜初始pH值范围及最适初始pH值。
2.2.8复合菌的生长和降解特性
将优势降解菌分别交叉划线，证明无拮抗作用后，进行后续试验。
2.2.8.1优势降解菌组合的确定
向已灭菌的基础培养液中加入500 mg.L-1聚丙烯酰胺。将各优势降解菌进行1:1组合培 养，于30 °C、120 rmin-1在摇床中培养10 d，每个处理设3次重复，依据各组降解菌对聚丙 烯酰胺的降解率和生长量的大小，最终确定出降解效果好的组合方式，即复合菌。
2.2.8.2复合菌的生长曲线和降解率曲线
复合菌的生长曲线和降解率曲线的试验具体操作同2.2.7.1。
2.2.8.3培养温度对复合菌生长和降解特性的影响
向已灭菌的基础培养液中加入聚丙烯酰胺，使其浓度为500 mg.L-1，加入复合菌在确定 的适宜时间振荡培养，其他具体条件和实验操作同2.2.7.3。
2.2.8.4底物浓度对复合菌生长和降解特性的影响
向已灭菌的基础培养液中加入聚丙烯酰胺，加入复合菌于确定最适温度下，确定的适宜 时间振荡培养，其他条件和操作同2.2.7.2。
2.2.8.5初始pH值对复合菌生长和降解特性的影响
向已灭菌的基础培养液中加入聚丙烯酰胺，使其浓度为最适底物浓度，使培养液的pH 值分别为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13，加入复合菌于确定的最适宜温度下， 确定的适宜时间振荡培养，其他条件和操作同2.2.7.4。
2.2.86不同碳氮源度复合菌降解聚丙烯酰胺的影响
基础培养液中分别加入NH4CI、石油、尿素、NH4NO3、牛肉膏、蛋白胨，使其浓度为 100 mg.L-1，灭菌后加入聚丙烯酰胺，使其浓度为最适底物浓度，调节pH达到最适值，接入 体积比2 °%的复合菌悬液，于上述确定的适宜温度和120 r.min-1在摇床中培养，按确定的适 宜时间取样，每个处理设3次重复，测定菌体生长量和聚丙烯酰胺的浓度，计算聚丙烯酰胺 的降解率，依据其大小判断不同碳氮源对复合菌对聚丙烯酰胺降解是否有影响。
2.2.9试验数据的处理
试验数据BLAST和SPSS处理，整理采用word完成制图。
23
3结果与分析
3.1聚丙烯酰胺降解细菌的分离与筛选
按照2.2.1中的方法，培养3d后，观察到10-4稀释度的平板中较合适分离菌落，挑取其 中有明显性状差异的菌落细菌于牛肉膏固体培养基中划线纯化，并将纯化后的菌株接入牛肉 膏斜面培基中培养养2d，长出菌落后，于4 °C保存。
按照2.2.2中的方法，最终分离纯化得到12株长势较好的聚丙烯酰胺耐性细菌，其中1#、 2#、3#、4#来自生产聚丙烯酰胺的工厂周围土壤，5#、6#、7#、8#、9#、12#、13#、14#来自 排水沟泥水。
将耐性细菌制成悬液，按2.2.2的方法培养，测定聚丙烯酰胺的降解情况。试验结果见 表 3-1。
表3-1 12株耐性细菌对聚丙烯酰胺的降解能力 Tab. 3-1 12 Halophilic bacteria on degradability of polyacrylamide
菌株1#2#3#4#5#6#7#8#9#12#13#14#
降解率
(%)8.324.233.217.414.99.632.128.018.325.14.0321.3
由表3-1可以看出，培养10 d后，各株降解菌降解率不相同，筛选出3#、7#和8# 3株 优势降解菌，分别命名为PAMB3、PAMB7和PAMB8。
3.2聚丙烯酰胺优势降解细菌的鉴定
3.2.1培养特征
按2.4.4.1中的方法培养聚丙烯酰胺优势降解细菌，观察平板上单菌落特征，见表3-2。
表3-2 PAMB3、PAMB7和PAMB8培养的菌落特征 Tab. 3-2 Cultural characteristics of PAMB3、 PAMB7 and PAMB8
菌株菌落形状菌落颜色基质颜色
PAMB3边缘整齐同心圆 略中心突起乳白色浅红色
PAMB7边缘整齐水滴状近透明颜色不变
PAMB8边缘整齐同心圆白色颜色不变
3.2.2形态特征
按照2.2.4.2的方法，将3株细菌制备扫描电镜标本，扫描电镜放大5 000倍数，观察结 果如图3-1、图3-2和图3-3所示。
图3-1 PAMB3的扫描电镜图片（巧000)图3-2 PAMB7的扫描电镜图片（x5 000)
Fig. 3-1 SEM image of PAMB3 (x5 000)Fig. 3-2 SEM image of PAMB7 ( x5 000)
图3-3 PAMB8的扫描电镜图片（x5 000) Fig. 3-3 SEM image of PAMB8 ( x5 000)
由图3-1、图3-2和图3-3可看出，3株菌均为杆菌，其中PAMB3和PAMB8为短杆菌， PAMB7为长杆菌；菌株PAMB3柱体长度为1.73~2.36 pm，直径为0.38~0.52 pm;菌株PAMB7 柱体长度为2.61~2.90 pm，直径为0.47~0.55 pm;菌株PAMB8柱体长度为1.23~1.59 ―，直 径为 0.51~0.69 pm。
25
3.2.3优势降解菌的生理生化特性
表3-3优势降解菌的生理生化特性
Tab. 3-3 Physiological and biochemical characteristics of bacteria
生理生化试验PAMB3PAMB7PAMB8
革兰氏染色+++
葡萄糖产酸+++
葡萄糖产气———
氧化酶++—
过氧化氢酶———
甲基红+—+
淀粉水解+++
产氨——+
硝酸盐还原+++
产吲哚++—
硫化氢反应+——
明胶液化+++
V-P试验+++
注：+为阳性。-为阴性
3.2.4优势降解菌的16S rRNA序列测定
按照2.2.4.3的方法提取菌株PAMB3、PAMB7和PAMB8的DNA，由上海生工生物工程 技术服务有限公司对其进行扩增及序列测定。3株细菌的16S rRNA测序长度分别为1 455 bp、 1 415 bp和1 422 bp，碱基组成见附录A、附录B和附录C，其序列在GeneBank数据库的登 陆号分别为：KF051998、KF051999和KF052000。利用BLAST对比、分析系统发育树（图 3-4、图3-5和图3-6)、结合高效降解细菌的菌落形态特征、菌体形态特征和生理生化特征， 初步鉴定PAMB3为芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌■roh/te)、PAMB7为芽孢杆菌属地衣 芽抱杆菌（)和PAMB8为类芽抱杆菌属解淀粉芽抱杆菌（ amyloliquefaciens)。
26
Bacillus subtlils partial (HE681728.1) Bacillus subtilis strain(JQ435698.1)
Bacillus megaterium strain (Q965768.1)
_| Bacillus safensis strain (JQ951230.1)
Bacillus pumilus strain(JQ965500.1)
Bacillus cereus strain(JQ951231.1)
Bacillus licheniformis strain (JQ8460)
0.2
Bacillus licheniformis strain BAB-2257 Bacillus licheniformis strain NBMS48 Bacillus thuringiensis strain (JQ9222) Bacillus aryabhattai strain (JQ965767.1) Bacillus megaterium strain (JQ951232.1) Bacillus amyloliquefaciens strain (JX(2) [Bacillus amyloliquefaciens strain (JX)
I PAMB7 (KF051999)
Bacillus licheniformis strain(GU21625)
图3-4聚丙烯酰胺优势降解菌PAMB3的系统发育树 Fig. 3-4 Phylogenetic tree of PAMB3
0.1
Bacillus cereus strain (JQ951227.1) Bacillus thuringiensis strain Bacillus thuringiensis strain (JX0513)
Bacillus cereus strain(JQ951231.1)
Bacillus vallismortis strain (JQ80669) PAMB8 (KF052000)
Bacillus amyloliquefaciens strain
Bacillus lentus strain NCIMB8773
图3-5聚丙烯酰胺优势降解菌PAMB7的系统发育树 Fig. 3-5 Phylogenetic tree of PAMB7
0.01
图3-6聚丙烯稀酰胺优势降解菌PAMB8的系统发育树 Fig. 3-6 Phylogenetic tree of PAMB8
27
Bacillus macauensis ZFHKF-1 (AKKV0100)
3.3聚丙烯酰胺优势降解菌的生长和降解特性
3.3.1优势降解菌以聚丙烯酰胺为唯一碳源或碳氮源的生长情况
按2.2.6的方法，优势降解细菌PAMB3、PAMB7和PAMB8在30 °C培养7d的恒温培 养箱里培养，观察到PAMB3不生长，PAMB7和PAMB8生长，因此，PAMB3不能以聚丙
烯酰胺为唯一碳源和唯一碳氮源进行生长，而PAMB7和PAMB8能以聚丙烯酰胺为唯一碳 源和唯一碳氮源进行生长。
PAMB7、PAMB8以聚丙烯酰胺为唯一碳源和唯一碳氮源时，10 d降解率分别为17.2%、 16.1 %和19.15 %、16.3 %。结果表明，PAMB7和PAMB8以聚丙烯酰胺为唯一碳源和唯一碳
氮源的降解率明显低于它们以聚丙烯酰胺为唯一氮源的降解率。故后续仅研究它们以聚丙烯 酰胺为唯一氮源的生长和降解特性。
3.3.2优势降解菌的生长曲线和聚丙烯酰胺降解曲线
按照2.2.7.1中的方法培养优势降解菌PAMB3、PAMB7和PAMB8，取样测定菌体生长
量和聚丙烯酰胺的浓度。3株菌的生长量及聚丙烯酰胺降解率的变化情况见图3-7、图3-8和 图 3-9。
13579
培养时间/d
0.4
0.3
0.2
0.1
0
图3-7 PAMB3的生长与降解曲线 图3-8 PAMB7的生长与降解曲线
Fig.3-7 Curves of PAMB3 growth and
Fig.3-8 Curves of PAMB7 growth and
polyacrylamide degradation polyacrylamide degradation
28
0.4
0.3
0.2
0.1
0
振荡培养7 d，取样分
-1
图3-9 PAMB8的生长与降解曲线 Fig.3-9 Curves of PAMB8 growth and polyacrylamide degradation
由图3-7、图3-8和图3-9可见，3株优势降解细菌经过短暂迟滞期，此阶段 的环境，自我调节适应新的生长环境，生长缓慢。随后进入对数生长期，此时菌 速、代谢旺盛，对聚丙烯酰胺的降解率也随之增大。其后菌体生长进入稳定期， 率和死亡率达到平衡，降解率达到稳定。
3株优势降解细菌的培养过程中细菌生长量和聚丙烯酰胺降解率的变化规律 先逐渐升高而后趋于稳定，到第7d后3株菌的生长量和降解率基本不变，由此 试验培养时间为7 d。
3.3.3底物浓度对优势降解菌生长和降解特性的影响
按2.2.7.2中的不同聚丙烯酰胺初始浓度配制方法配制基础培养液，然,
PAMB3、PAMB7 和 PAMB8 菌悬液，于 30 °C，120 :
囷株进入新 株生长量迅 细菌的生长
一致，均为
可选择后续
后分别接入 r析，3株菌
2所示。
0.4
0.3
0.2^
0.1
0
LJ6)E/_ 澳盘
20o o o
的生长量、聚丙烯酰胺降解率和降解量的变化情况，如图3-10、图3-11和图3-1
图3-10聚丙烯酰胺底物浓度对PAMB3生长和降解的影响 Fig. 3-10 Effects of the initial concentration of polyacrylamide on PAMB3 grow
polyacrylamide degradation
29
0.4
0.3
0.2
0.1
0
180
150
120
90
60
30
0
图3-11聚丙烯酰胺底物浓度对PAMB7生长和降解的影响 Fig.3-11 Effects of the initial concentration of polyacrylamide on PAMB7 growth and
polyacrylamide degradation
40
35
30
25
20
15
10
5
0
"eE/_ 邀盤
30o
o o o
8 5 2 0 1119
502005001000
底物浓度/mg.L-1
0.4
0 5 2 1
%/齋邀盤
降〇解率
0
02005001000
底物浓度/mg.L-1
图3-12聚丙烯酰胺底物浓度对PAMB8生长和降解的影响 Fig.3-11 Effects of the initial concentration of polyacrylamide on PAMB8 growth and
polyacrylamide degradation
从图3-10、图3-11和图3-12可以看出，3株优势降解菌对不同浓度聚丙烯酰胺均有降解 效果，且3株菌生长量、聚丙烯酰胺的降解率和降解量均随底物浓度增大而呈现先升高后降 低的趋势，虽然3株菌适宜范围不同，但总体趋势相同。3株菌对聚丙烯酰胺的降解作用有 一定的适应范围，当浓度高时，聚丙烯酰胺的水解度下降，且会对菌体本身造成毒害作用， 抑制菌株生长和降解作用；当浓度过小时，氮源不足导致菌株生长缓慢。
从图3-10可看出，在50〜1 500 mg.L-1底物浓度范围内，PAMB3的生长量、对聚丙烯酰 胺降解率和降解量各最高值相应的底物浓度不同，分别出现在700 mg.L-1、300 mg.L-1和500 mg.L-1处。结合菌株的生长量、聚丙烯酰胺降解率和降解量变化情况，选择500 mg.L-1为较 佳底物浓度。按照聚丙烯酰胺降解率大于20 %计，PAMB3降解适宜底物浓度范围为200〜 700 mg-L-1。
由图3-11可看出，PAMB7在底物浓度50〜1 500 mg.L-1之间，PAMB7的生长量、聚丙
30
烯酰胺的降解率和降解量各最高值对应的底物浓度不完全相同，分别出现在500 mg.L-1、300 mg.L-1和500 mg.L-1处。结合菌株的生长量、对聚丙烯酰胺的降解率和降解量变化情况，选 择聚丙烯酰胺浓度为500 mg.L-1为较佳底物浓度。按照聚丙烯酰胺降解率大于20 %计， PAMB7降解适宜底物浓度范围为50〜700 mg-L-1。
由图3-12可看出，PAMB8的生长量、聚丙烯酰胺的降解率和降解量各最高值对应的底 物浓度不完全相同，分别出现在500 mg.L-1、300 mg.L-1和700 mg.L-1处。结合菌株的生长量、 对聚丙烯酰胺的降解率和降解量变化情况，选择聚丙烯酰胺浓度为500 mg_L-1为较佳底物浓 度。按照聚丙烯酰胺降解率大于20 %计，PAMB8降解适宜底物浓度范围为100〜700 mg.L-1。
3.3.4培养温度对优势降解菌生长和降解特性的影响
0.4
0.3
0.2
0.1
0
按照2.2.7.3的方法，将菌悬液接入含底物浓度500 mg.L-1基础培养液中，于不同温度、 120 rmin-1振荡培养7 d取样，菌体生长量和聚丙烯酰胺降解率变化情况见图3-13、图3-14 和图 3-15。
图3-13培养温度对PAMB3生长和降解的影响 Fig. 3-13 Effects of temperature on PAMB3 growth and polyacrylamide degradation
由图3-13可看出，当环境温度在15〜45 °C之间时，PAMB3对环境温度较敏感，降解 菌的生长量、聚丙烯酰胺降解率的随温度变化呈快速增大后快速降低的趋势。在低温15 °C 和高温45 C时，PAMB3仍有一定的生长量和降解率，表明PAMB3对温度具有很好的耐受 性。当环境温度30 C时，聚丙烯酰胺降解率达到最大值，当温度35 C时，生长量达到最大 值。因此，PAMB3的适宜温度为30 C。按照聚丙烯酰胺降解率大于20 %计，PAMB3降解 适宜环境温度范围为25〜40 C。
31
0.4 0.3 0.2 ： 0.1 0
图3-14培养温度对PAMB7生长和降解的影响 Fig. 3-14 Effects of temperature on PAMB7 growth and polyacrylamide di
egradation
聚丙烯酰胺的降 ，菌株生长量和 ，降解率达到最 C和40〜45 C 〜35 C PAMB7
%/齋邀盘
崾§
15202530354045
培养温度/°C
从图3-14可看出，PAMB7环境温度在25〜35 C时，聚丙烯酰胺降解细菌的筛选及降解特性,菌体的生长量和 解率较高，变化不大。当环境温度在20〜25 C之间时，随着环境温度升高 聚丙烯酰胺降解率迅速的上升，25 C时，菌体生长量达到最大值；30 C时 大值；35 C后菌体生长量和聚丙烯酰胺降解率迅速下降。环境温度15〜20 时，菌体的生长量和聚丙烯酰胺的降解率低。因此可确定适宜温度范围为25〃 的最适温度为 30 C。
图3-15培养温度对PAMB8生长和降解的影响 Fig. 3-15 Effects of temperature on PAMB8 growth and polyacrylamide deg]
由图3-15可看出，PAMB8对环境温度反应敏感，在温度为15〜30 C 降解率迅速升高，生长量15〜20 C略有增加后迅速上升，35 C时降解率和 当环境温度高于35 C时，菌株的生长量和降解率快速下降，环境温度15 C 菌株降解率低。按照聚丙烯酰胺降解率大于20 %计，PAMB8菌株的适宜温; C，最适宜温度为35 °C。
adation
时，聚丙烯酰胺 长量达最大值 :或40〜45 C时 度范围是25〜35
32
0.4
0.3
0.2
0.1
0
按照2.2.7.4的方法，配制初始pH值不同的基础培养液，灭菌后加入聚丙烯酰胺使其浓 度为500 mg.L-1，再加入菌悬液，使PAMB3和PAMB7环境温度为30 °C，PAMB8环境温度 为35 °C，在120 rmin-1条件下振荡培养，7 d取样，测菌株的生长量和聚丙烯酰胺的降解率， 结果pH对3株优势降解菌的生长量、聚丙烯酰胺降解率的影响大，其具体变化情况见图3-16、 图3-17和图3-18。
图3-16初始pH值对PAMB3生长和降解的影响 Fig. 3-16 Effects of pH on PAMB3 growth and polyacrylamide degradation
0.4
0.3
0.2
0.1
0
初始pH
由图3-16可看出，降解菌PAMB3对pH敏感，在pH值小于4或大于12时菌株几乎不 生长。当pH值在3〜8时，其生长量和降解率随pH值升高而迅速升高；当pH值在8〜9时 缓慢升高，在pH值为9时PAMB3的生长量和聚丙烯酰胺降解率达最大值；当pH值在9〜 10时，生长量和降解率缓慢降低；pH超过10时其迅速降低。按照聚丙烯酰胺降解率大于20% 计，PAMB3菌株的适宜范围为6〜11，最适pH值为9,说明该菌株适合在pH值中性偏碱性 条件下生长。PAMB3在最适条件下对聚丙烯酰胺降解率为45.0 %。
图3-17初始pH值对PAMFB7生长和降解的影响 Fig. 3-17 Effects of pH on PAMB7 growth and polyacrylamide degradation
33
由图3-17可以看出，菌株PAMF7的生长量与聚j 变化幅度较大。pH值在3〜8之间，其生长量和降解率 为8时菌体生长量和降解率均达到最大值；当pH值大 的升高而迅速减小。pH值小于4或大于12时菌株几2 酰胺降解率大于20 °%计，PAMB7的适宜pH值为6〜 宜在中性偏碱性环境中生长。在最适条件下，PAMB7
[率随pH变化基本一致。 由升高而迅速升高，pH值 ^长量和降解率均随pH值 解率也较低。按照聚丙烯 值为8,表明该降解菌适 g降解率为39.9 %。
丙烯酰胺降解 S随着pH值控 于8时，其生 P不生长，降 11，最适pH 对聚丙烯酰胺
5C
4C
30
20
0.4
0.3
0.2
0.1
C
3456789 1C
初始pH
)11 12
图3-18初始pH值对PAMB8生 Fig. 3-18 Effects of pH on PAMB8 growth ant
由图3-18可看出，PAMB8在pH值小于4或大于
6时，PAMB8的生长量和聚丙烯酰胺降解率随pH值升 生长量和降解率迅速升高；在8〜9时，缓慢升高，pH pH值10后，其生长量和降解率快速降低。按照聚丙类 株的适宜pH为7〜10,最适pH值为9,即该菌株适宜碱 对聚丙烯酰胺降解率为36.2 %。
3.4复合菌的生长和降解特性
长和降解的影 1 polyacrylam
ide degradation
12时菌株几: f高缓慢增长 I值为9时达 令酰胺降解率 时生环境中生-
乎不生长。当pH值在3〜 ;当pH值在6〜8时，其 到最大值。随后降低，当 大于20°%计，PAMB8菌 长。在最适条件下，PAMB8
C
3.4.1复合细菌的降解组合优化
经拮抗实验表明，3株优势降解菌均无拮抗作用。按照2.2.8.1的方法，聚丙烯酰胺降解细菌的筛选及降解特性,配制基础培养液， 灭菌后加入聚丙烯酰胺使其浓度为500 mg.L1，再加入3 °%不同体积菌悬液，与30 °C、120 r-min-1条件下震荡培养，10 d取样，测复合菌生长量和聚丙烯酰胺的降解率，变化情况见表 3-3。
34
表3-3复合菌组合方式及降解率
Tab. 3-3 Compound mode of degrading-polacrylamide bacteria and degradation rate
组合378降解率（％)
三株0.670.670.6758.4±1.75
1.51.5052.6±2.08
两株1.501.538.7±1.94
01.51.530.4±1.21
由表3-3可知，等体积比的3株菌组合及PAMB3、PAMB7组合的降解率较高，均明显 高于各单菌，表明3株菌间有明显的协同作用，尤其是PAMB3与PAMB7。将这两种组合方 式分别命名为PB378和PB37。
3.4.2复合菌的生长曲线和降解率曲线
0
oooooo
6 5 4 3 2 1
%/齋邀盤
1357
培养时间/d
0
0
oooooo
6 5 4 3 2 1
%/齋邀盤
13579
培养时间/d
0
图3-20 PB37的生长与降解曲线 Fig.3-20 Curves of PB37 growth and polyacrylamide degradation
图3-19 PB378的生长与降解曲线 Fig.3-20 Curves of PB378 growth and polyacrylamide degradation
按照2.2.8.2中的方法培养混合菌PB378和PB37，取样测定菌体生长量和聚丙烯酰胺的 浓度，混合菌的生长量及聚丙烯酰胺降解率的变化情况见图3-19和图3-20。
由图3-19和图3-20可知，PB378和PB37的培养过程中，其生长量和聚丙烯酰胺降解率 的变化规律一致，均为先逐渐升高而后趋于稳定。在1〜3d为复合菌生长的延滞期，复合菌 迅速生长、聚丙烯酰胺降解率变化不大；在3〜8 d为复合菌生长的指数期，复合菌迅速生长、 聚丙烯酰胺降解率迅速增大；8 d后趋于稳定。因此，可确定后续试验的培养时间为8 d。
35
图3-22培养温度对PB37生长 和降解的影响
Fig. 3-22 Effects of temperature on PB37 growth and polyacrylamide degradation
图3-21培养温度PB378生长
和降解的影响
Fig. 3-21 Effects of temperature on PB378 growth and polyacrylamide degradation
按照2.2.8.3的方法，将PB378和PB37菌悬液接入含底物浓度500 mg-L-1基础培养液中， 于不同温度、120 rmm-1振荡培养8 d取样分析，菌体生长量和聚丙烯酰胺降解率变化情况见 图3-21和图3-22。
从图3-21和图3-22可看出，在环境温度20〜50 °C时，对2组复合菌的生长量、聚丙烯 酰胺降解率的影响均呈现先增大后降低的趋势。2组复合菌均能在45 °C以下生长和降解聚丙 烯酰胺。当环境温度30 C时，其生长量和对聚丙烯酰胺降解率均达到最大值。按照聚丙烯 酰胺降解率大于20 °%计，复合菌PB378和PB37的适宜环境温度均为20〜40 C，最适温度 为 30 C。
3.4.4底物浓度对复合菌生长和降解特性的影响
按照2.2.8.4中的方法，配置不同底物浓度的基础培养液，培养PB378和PB37, 8 d取样 测定菌体生长量和聚丙烯酰胺的浓度，混合菌的生长量及聚丙烯酰胺降解率的变化情况见图 3-23 和图 3-24。
从图3-23和图3-24可看出，PB378和PB37的生长量和降解率随底物聚丙烯酰胺的浓度 变化一致，均呈先升高后降低趋势。底物聚丙烯酰胺浓度在300〜700 mg.L-1之间时，PB378 对聚丙烯酰胺降解率较高，而其生长量较高值在底物浓度为300〜1 000 mg.L-1之间，说明 PB378对聚丙烯酰胺有较好的适应能力。PB378和PB37的生长量和对聚丙烯酰胺降解率最 高值相应的底物浓度相同，均出现在700 mg.L-1处。按照聚丙烯酰胺降解率大于20 %计，复 合菌PB378和PB37的适宜聚丙烯酰胺浓度为50〜1 000 mg.L-1，最适浓度为700 mg-L-1。
36
0
o o o o o
6 5 4 3 2
%/腾裳逖
0
0
o o o o o
6 5 4 3 2
%/腾裳逖
1200
_°0
0
图3-24底物浓度对PB37生长和 降解的影响
Fig. 3-24 Effects of the initial concentration of polyacrylamide on Curves of PB37 growth and polyacrylamide degradation
50200500800
底物浓度/mg*L-1
502005008001200
底物浓度/mg*L-1
图3-23底物浓度对PB378生长和
降解的影响
Fig. 3-23 Effects of the initial concentration of polyacrylamide on Curves of PB378 growth and polyacrylamide degradation
3.4.5初始pH值对复合菌生长和降解特性的影响
按照2.2.8.5的方法，配制不同初始pH值、底物浓度为700 mg.L-1的基础培养液，分别 加PB378和PB37复合菌，在环境温度为30 °C、120 r.min-1条件下振荡培养，8 d取样，狈J
o o o o o o o
7 6 5 4 3 2 1
%/腾裳逖
_}ao
T 0.4 0.3 0.2 0.1 0
pH
图3-26初始pH值对PB37生长
和降解的影响
Fig. 3-26 Effects of pH on PB37 growth and polyacrylamide degradation
图3-25初始pH值对PB378生长
和降解的影响
Fig. 3-25 Effects of pH on PB378 growth and polyacrylamide degradation
37
2组复合菌的生长量和聚丙烯酰胺的降解率，其变化情况见图3-25和图3-26。
从图3-25和图3-26可看出，pH对2组复合菌的生长量、聚丙烯酰胺降解率的影响的变 化趋势基本一致，均呈现先增大后降低的趋势。PB378和PB37对pH的适应性非常强，当 pH值在4〜12之间时，2组复合菌均能很好的生长，在pH值小于2或大于13时菌株几乎不 生长。在pH为9时PB378生长量和聚丙烯酰胺降解率达到最大值，而PB37在pH为8时达 到最大值。按照聚丙烯酰胺降解率大于20 %计，聚丙烯酰胺降解细菌的筛选及降解特性,复合菌PB378适宜pH范围为5〜12，最适 pH为9; PB37的适宜pH范围为5〜11，最适pH为8。PB378和PB37在各自最适条件下对 聚丙烯酰胺降解率分别为58.2 %和57.8 %。
3.4.6不同碳氮源对复合菌降解的影响
按照2.2.8.6的方法，配制浓度为100mg-L-1的NH4CI、石油、尿素、NH4NO3、牛肉膏、 蛋白胨的基础培养液，使底物浓度为700 mg.L-1，分别加PB378和PB37，以3.4.5的最佳条 件培养为空白试验，在初始pH分别为9和8，温度为30 °C，120rmin-1条件下振荡培养，8
iri
rtn
i-t.
o o o 2 1
(％)赚遨激
PB378 □ PB37
*
d取样，测2组复合菌的生长量和聚丙烯酰胺的降解率，结果见图3-27。
空白氯化铵硝酸铵尿素石油牛肉膏蛋白胨
不同碳氮源
图3-27不同碳氮源对复合菌降解的影响 Fig. 3-27 Effects of different nitrogen source on polyacrylamide degradation
从图3-27可看出，加入少量NH4CI和NH4NO3时，PB378和PB37对聚丙烯酰胺降解率 均有增加，分别为60.9 °%、60.4 °%和58.8 °%、59.5°%；加入少量石油时，2组复合菌对聚丙
烯酰胺降解率无明显变化，表示石油对复合菌的生长和代谢无明显影响。但加入尿素、牛肉 膏和蛋白胨时，2组复合菌对聚丙烯酰胺降解率很低。
38
4讨论
4.1聚丙烯酰胺降优势降解细菌的分离、筛选和鉴定
虽然可降解特定物质的微生物在环境中数量较少，可通过训化和富集获得活性和降解性 较强的特定微生物。目前以获知的降解聚丙烯酰胺的细菌主要有硫酸盐还原菌、产碱假单胞 菌、腐生菌、梭状芽孢杆菌等。
本试验采用平板胁迫法从生产聚丙烯酰胺的工厂周围土壤和排水沟泥水分离出降解聚丙 烯酰胺的细菌。经长期的平板驯化培养后，适应性强的菌种存活下来，并且适应能力逐渐增 强，最后分离、筛选出3株可高效降解聚丙烯酰胺优势菌种。通过观察菌落形态和菌体形态、 细菌的生理生化特性及16SrRNA基因序列分析对3株优势降解菌进行鉴定，分别确定 PAMB3、PAMB7为芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌沛fcO、地衣芽孢杆菌 //cAe«(/^rOT/5〇，PAMB8为类芽抱杆菌属解淀粉芽抱杆菌（Sac/WMS aOTj/o/^gMeyhc/ews)。其中 地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌未见可降解聚丙烯酰胺报道，枯草芽孢杆菌已有报道，如常 帆等[112]筛选出枯草芽孢杆菌FA16。
4.2聚丙烯酰胺优势降解菌及其复合菌的生长和降解特性
影响微生物生长繁殖的因素有很多，主要包括营养物质、温度和pH，当环境因素发生改 变时，微生物的生长状况也会发生变化，当环境因素剧烈变化或改变幅度较大时，则可能会 导致微生物死亡[127]。本试验采用单因子变化法，研究不同环境因素对优势降解菌的影响以确 定降解菌的最佳降解条件。
微生物的降解能力不单体现在降解率上，还体现在降解量和适应底物浓度上。在实际应 用中还要考虑环境温度、pH等因素。
本试验筛选的3株单菌及复合菌特性如下：
对于底物浓度，3株单菌及复合菌在50〜1 500 mg.L-1浓度的聚丙烯酰胺培养液中，生长 量和降解率均呈现先升高再稳定后迅速下降的趋势。各单菌适宜的底物浓度分别是：PAMB3 200〜700 mg-L-1，PAMB7 50〜700 mg-L-1，PAMB8 100〜700 mg-L-1。复合菌 PB378 和 PB37
对底物浓度的适宜范围均为50〜1 000 mg.L-1，可以看出各单菌对底物浓度适应范围不同，均 小于复合菌PB378、PB37的浓度，表明单菌复配后适应底物浓度能力增强。3株优势降解菌 的最佳底物浓度均为500 mg.L-1，而复合菌PB378和PB37为700 mg.L-1，说明单菌复配后最 佳降解底物浓度增加200 mg.L-1，降解能力明显增强。
对于环境温度，是微生物生长繁殖的重要因素，一方面温度过高会使生物酶失活，会对 生物体产生巨大的损害，甚至死亡；另外，温度过低则会抑制生物体活性，使生长繁殖停止。 本试验目的在于找到适宜每个优势降解菌最适宜的温度范围，以达到高效降解聚丙烯酰胺的 目的。结果显示，3株单菌及复合菌最佳生长和降解的环境温度均为30 °C，而适宜的环境温
39
度范围不尽相同。PAMB3的适宜温度范围是25〜40 °C，PAMB7和PAMB8是25〜35 °C， 而 PB378 和 PB37 是 20〜40 °C。可以看出，PAMB3+PAMB7+PAMB8 复配（PB378)和 PAMB3+PAMB7复配（PB37)适宜温度范围比单菌宽，从适应环境温度看，3株单菌及复合 菌均有较好地适应性，与自然环境温度接近，复合菌更实用些。
对于pH值，一般石油行业含聚丙烯酰胺的污水为偏碱性，聚丙烯酰胺降解细菌的筛选及降解特性,因此降解菌的适宜pH范围为 降解含聚丙烯酰胺污水的重要条件之一。本试验结果表明，PAMB3和PAMB7适宜pH范围 为6〜11，PAMB8为7〜10，PB378为5〜12，PB37为5〜11，可以看出复合菌的适宜pH 更宽些。PAMB3、PAMB8和PB378最适pH值是9，PAMB7和PB37最适pH值为8，无论 是单菌还是复合菌最适宜pH值在8〜9,偏碱性，单菌和复合菌均适合处理石油行业含聚丙 烯酰胺的污水，复合菌更具优势。
对于降解率，在各自最佳条件下，单菌PAMB3、PAMB7、PAMB8对聚丙烯酰胺的降解 率分别为45.0 %、39.9%、36.2%;复合菌PB378、PB37的降解率分别为58.2 %、57.8%。 可以看出复合菌降解率明显高于单菌，表明PAMB3、PAMB7间和PAMB3、PAMB7、PAMB8
间均具有明显的协同作用。
Jeanine L. Kay-Shoemake等[119’ 120]筛选出的微生物能以聚丙烯酰胺作为唯一氮源被微生 物所利用，温度为30 C条件下培养7 d后，1 000 mg七―1的聚丙烯酰胺溶液黏度降低19.6 %。 包木太等[110]筛选的降解菌在聚丙烯酰胺溶液浓度为500 mg.L-1、pH值为7.5、温度为35 C 的条件下，降解率最高可达到38.4 %。常帆等[112]将筛选出枯草芽孢杆菌FA16和假单胞菌 CJ419,两株菌联合降解5 d的降解率为35.6 %。而本实验的枯草芽孢杆菌PAMB3的降解500 mg *L-1聚丙烯酰胺的降解率为45.0 %，与地衣芽孢杆菌PAMB7联合降解率达到58.2 %，可 见本实验获得的菌株降解能力是较高的。
郝春雷[109]等筛选4株聚丙烯酰胺降解菌种，复配试验表明，在37〜45 C，pH6.4〜8.0 时，复合菌对聚丙烯酰胺有较强的降解能力，可将其溶液黏度降低约61 %。李宜强等[104]筛 选3株兼性菌组成，降解聚丙烯酰胺温度为45 C，且聚丙烯酰胺溶液粘度明显降低。可以 看出以上复合降解菌的培养温度较高，在实际应用中消耗的能量相对较高。本实验在环境温 度为30 C时，聚丙烯酰胺降解率和菌株生长量达到最大值，更适宜应用在常温下的原位修 复，且所用菌株均适宜在pH为8〜9环境下生长，由于实际聚驱采油废水偏碱性(pH7-10[128])， 更适合应用在采油废水中聚丙烯酰胺的降解。
4.3不同碳氮源度复合菌降解聚丙烯酰胺的影响
由于聚丙烯酰胺是大分子有机物，微生物要利用其中氮源必须先释放特定酶，使其酰胺 键断裂，而后微生物利用产生的氮源大量繁殖。加入特定氮源后，微生物会先利用它生长， 并产生酶使酰胺键断裂，从而加快降解聚丙烯酰胺的速度。本试验结果表明，加入少量氯化 铵、硝酸铵和石油对降解无影响，说明无机氮源对复合菌的生长和降解无明显影响，并且两 组复合菌可用于采油污水中聚丙烯酰胺的处理。而加入尿素、牛肉膏和蛋白胨时2组复合菌 对聚丙烯酰胺降解率很低，说明添加有机氮源，对聚丙烯酰胺的降解具有竞争作用。
40
由于聚丙烯酰胺多用于提高油田生产采收率，聚丙烯酰胺降解细菌的筛选及降解特性,含聚丙烯酰胺污水多为偏碱性液体（pH值 在7.5〜8.5[128])，且含有一定的石油。由于本试验获得的复合菌具有适应底物浓度大、常温 环境温度、pH范围宽的特性，尤其是最适合中性偏碱性环境中生长，加之污水中石油对其降 解聚丙烯酰胺无影响，说明其非常适用于实际应用，尤其是应用于采油污水处理。
41
5结论
5 1优势降解细菌的筛选及鉴定
采用平板胁迫方法从大庆生产聚丙烯酰胺化工厂厂区土样和排水沟泥水筛选出3株以聚 丙烯酰胺为唯一氮源聚丙烯酰胺优势降解菌PAMB3、PAMB7和PAMB8。
通过平板培养和扫描电镜对菌落形态和菌体形态观察及细菌的生理生化特性试验、16S rRNA基因序列分析，对3株优势降解菌进行鉴定，初步确定PAMB3、PAMB7分别为芽孢 杆菌属的枯草芽抱杆菌（方ac/7/狀)、地衣芽抱杆菌（方ac/7/w6* //^伙价削)，确定PAMB8 为类芽孢杆菌属的解淀粉芽孢杆菌（召此///狀)。
PAMB7和PAMB8均可以聚丙烯酰胺为唯一碳源、唯一氮源和唯一碳氮源生长，而 PAMB3仅能以聚丙烯酰胺为唯一氮源生长。
5 2聚丙烯酰胺降解菌的生长及降解特性
以聚丙烯酰胺为唯一氮源对3株优势降解细菌的生长及降解聚丙烯酰胺的情况进行研 究，试验结果表明：
PAMB3的适合初始聚丙烯酰胺浓度为200〜700 mg.L-1，最适底物浓度为500 mg.L-1;适 合pH值为6〜11，最适合的初始pH值9;适合温度为25〜40 °C，最适温度为30 °C。在最 佳条件下对聚丙烯酰胺降解率为45.0 %。
PAMB7的适合初始聚丙烯酰胺浓度为50〜700 mg.L-1，最适底物浓度为500 mg.L-1;适 合pH值范围为6〜11，最适合的初始pH值8;适合温度为25〜35 C，最适温度为30 C。 在最佳条件下对聚丙烯酰胺降解率为39.9 %。
PAMB8的适合初始聚丙烯酰胺浓度为100〜700 mg.L-1，最适底物浓度为500 mg.L-1;适 合pH值范围为7〜10，最适合的初始pH值9;适合温度为25〜35 C，最适温度为35 C。 最佳条件下对聚丙烯酰胺降解率为36.2 %。
5 3复合菌的生长及降解特性
以聚丙烯酰胺为唯一氮源，将3株降解菌进行组合降解实验，结果显示，聚丙烯酰胺降解细菌的筛选及降解特性,PB378(PAMB3、 PAMB7和PAMB8组合）和PB37 (PAMB3和PAMB7组合）对聚丙烯酰胺降解率较高。研 究2组复合菌的生长及降解情况，试验结果表明：
PB378和PB37的适合初始聚丙烯酰胺浓度为500〜1 000 mg-L-1，最适浓度为700 mg-L-1; 适合温度为20〜40 C，最适温度为30 °C。PB378适合初始pH值范围为5〜12,最适合pH 为9; PB37适合初始pH值范围为5〜11，最适合pH为8;在各自最佳条件下，PB378和PB37 对聚丙烯酰胺的降解率分别为58.2 %和57.8 %。
与复合菌中单菌相比，PB378和PB37的降解聚丙烯酰胺的能力及对底物浓度、环境温
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度及pH值的适应能力更强，更具实用性。
5 4不同碳氮源度复合菌降解聚丙烯酰胺的影响
试验结果表明，在最佳条件下，加入少量NH4CI和NH4NO3时，PB378和PB37的降解 率分别为60.9 %、60.4 %和58.8 %、58.3%，与不加NH4CI和NH4NO3组无明显差异，表明 NH4CI和NH4NO3对复合菌的生长和代谢无明显影响；加入少量石油时，两组复合菌的降解 率均无明显变化，表示石油对复合菌的生长和代谢无明显影响。但加入尿素和牛肉膏时两组 复合菌的降解率很低。表明尿素和牛肉膏对PB378和PB37降解聚丙烯酰胺具有竞争代谢作用。
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