琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳技术检测：

琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳技术检测，琼脂糖凝胶和5%(w/v)的聚丙烯酰胺凝胶电泳对小麦白粉病抗、感特 性品种基因组DNA的RAPD检测结果表明：5%聚丙烯酰胺凝胶对线性DNA分子(0■ 1~ 2.0kb)和 长度相差100bp以下的DNA分子的分离较2.0%的琼脂糖凝胶电泳效果好。因此，我们研究出 了 I项利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测小麦白粉病抗、感特性的新技术，在工作中建立了 |种适合 于检测小麦基因组DNA结构差异的电泳方法。该方法主要包括:（1)丙烯酰胺和亚甲基双丙烯 酰胺的新配比;（2)分离DNA片段的最佳凝胶浓度;（3)电泳条件;（4)脱色、漂洗、银染、显色过 程。实验发现，该技术对于小麦白粉病抗、感特性检测中的小片段和长度相差100bp以下的线性 DNA PCR扩增结果的分辨效果较好。应用该技术在抗感品种间已经发现了 DNA水平上的差异。 关键词小麦白粉病琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳

琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel， PAG)电泳是分离、鉴定和纯化DNA片段的标准方 法[1]。二者相比较聚丙烯酰胺分离小片段DNA( 5 ~ 500bp)效果最好，琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳技术检测，其分辨力极高，用于测序的聚 丙烯酰胺凝胶可分离相差1bp的DNA片段，而且 聚丙烯酰胺凝胶所能装载的DNA量可以是琼脂糖 凝胶的几倍，从聚丙烯酰胺凝胶中回收的DNA纯 度也比琼脂糖凝胶高，可用于序列分析[1]。但与琼 脂糖凝胶相比，其制备和操作更为困难。

我们通过用2.0%的琼脂糖、5%聚丙烯酰胺凝 胶对小麦白粉病抗、感特性品种基因组DNA的 RAPD扩増结果进行了比较分析，经过方法技术改 进，最终确定了一种简单、适宜的聚丙烯酰胺凝胶 电泳方法，这一方法己在我们的研究中应用，取得 了较为满意的结果。

1材料与方法

1.1供试小麦种子

供试材料共两份:感病亲本普通小麦京411;

抗病杂交后代4112//015^腦]^5(8匚2卩5)是抗病亲 本普通小麦Brock和感病优良品种015杂交后，再 和感病优良品种普通小麦京411回交2次后，自交 4次从而得到的第5代种子。种子材料由中国农 业大学提供。

1.2主要试剂及仪器

琼脂糖(Agarose)、丙烯酰胺(Acr)、亚甲基双丙 烯酰胺（Bis)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、N，N，N"， N-四甲基乙二胺(TEMED)均购自上海生物工程公 司；硼酸（borio acid)、乙二胺四乙酸二钠盐 (EDTANa2)、氢氧化钠(NaOH)、过硫酸铵(AP)均为 国产分析纯。

恒压恒流DF^D型电泳仪(北京东方特力科贸 中心)，DYY- II型水平电泳槽，双垂直板电泳槽(胶 板面积200mm x 200mm，北京六一厂产），间隔片，

梳子夹子若干。

13小麦总体DNA的提取与RAPD随机扩增

1. 3. 1小麦总体DNA的提取各取材料10粒，经 安替福民消毒，琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳技术检测，自来水浸泡使之吸涨后22~ 24°C闭 光培养至黄化苗长至5~ 6cm即可。DNA的提取参 阅 StwaitJe CN. (1994)和 Mcdonald M. B. (1994)酚、 仿抽提，乙醇沉淀的方法，略作改动。

检测后作为PCR扩増的模板。扩増条件参考 Williams^2]和Welsh[4]的方法，略作改动：总体系为 25W，各组分物质的含量分别为template 20ng; 1〇x Buffer 2. 5Wl; MgCl2 0.3mmol/L; dNTP 0.2mmol/L; primer iym〇V L; Taq 1 ■ 5U，ddH2〇 补齐 25W，混匀，离 心收集，在PTC-150^25上进行反应，反应程序参考 Wang Xinyu[5]的方法略作改动:96 °C变性1min，35 °C 退火1min，72 °C延伸2min，3个循环，94 °C变性45s， 36°C退火1min，72°C延伸90s，共45个循环，最后 72°C 补齐 10min。

1.4琼脂糖凝胶制备及电泳系统

1.4.1缓冲液贮液制备贮液用50 x TAE: Tiis 24. 2g，冰醋酸 5.71ml，0■ 5m〇l/L EDTA( pH8. 0) 10ml

加蒸馏水至100ml配制。用时稀释50倍。

1.4.2凝肢配比2.0%的琼脂糖凝胶0.4g琼脂 糖力卩1xTAE 20ml。配胶时加入染色剂溴化乙锭 (EB 1mg/ml) 1W。

1.4.3 电泳上样量8W，50V电压电泳1.5h，终

止电泳。电泳后用紫外反射透射分析仪在透射光 下观察并照相。

1.5聚丙烯酰胺凝胶制备及电泳系统

1.5.1缓冲液贮液制备贮液用5x TBE: Tiis 54g，硼酸 27. 5g，0■ 5mol/L EDTA( pH 8.0) 20ml 加蒸 馏水至1000ml配制。用时稀释5倍。

1.5.2凝肢母液制备母液用40% Acr: Acr7%， Bis 2g加蒸馏水至200ml配制。

1.5.3适合本实验的凝肢配比40% Acr 4ml，5 x TBE 6ml，H2O 21.5ml，AP 0.06g，TEMED 20^l。

1.5.4 电泳上样量6W，55V电压电泳12h，终止 电泳。环境温度以15~ 24°C为宜。

1.5.5染色、显色将凝胶加入到1% AgN〇3

250ml(含375W甲醛）中，染色30min; 250ml蒸馏水 漂洗一遍;加入30%预冷的Na2C〇3(含375W甲醛 和0.5mg的硫代硫酸钠)250ml显色至出现清晰的 DNA银染条带;最后加入10%冰醋酸250ml终止反 应，然后照相或制干胶保存。

2结果与分析

2.1 PAGE系统的改进

2.1.1确定Acr和Bis的配比 PAGE作为一种常 用的蛋白质分析技术[6]，适用于低分子量蛋白质 至少包含29个丙烯酰胺单体，凝胶中网格的孔径 由Acr和Bis的相对比例决定，其中亚甲基双丙烯 酰胺的浓度越低，孔径越大。适用于分离大分子物 质[7]。不同研究者所使用的凝胶中Acr与Bis的比 例相差较大。在蛋白质研究中李爱芬等[8]比较了 Acr 和 Bis4 种不同比例（30: 0.8, 50: 1，100: 1，150: 1)的分离胶对裙带菜色素蛋白质复合物的电泳效 果的影响，发现不同的Acr和Bis比例对电泳分离 结果没有显著影响，但分离胶中若Ac•和Bis的比 例太大，如100 1以上，分离胶太软，电泳后胶条不 容易剥离。由于本实验希望在几百到一、两千屮 范围得到较好的分离效果，需要孔径稍大的聚丙烯 酰胺凝胶就可满足分离要求。并参考微卫星DNA 电泳时的凝胶配比，最终确定了 39: 1的Acr与Bis 比例作为最终配比，足以得到清晰的条带。

2.1.2最佳凝肢浓度参考刘峰等[9]的微卫星 DNA电泳时的凝胶配比，我们先后以4 5%、5%、 6%、％的聚丙烯酰胺浓度电泳分析RAPD扩増结 果，发现胶浓度为4 5%时，胶稀软，浓缩效应差， 操作难;随着胶浓度的増大对小片段DNA的分离 效果提高，相近分子量DNA片段的分辨力増强，但 随着胶浓度的加大，无论怎样増加电泳时间，一些 大片段DNA都会滞留在凝胶的上端，从而影响对 大片段的分析。琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳技术检测，而且胶浓度为6%、％的凝胶脆 硬，拔梳子时容易损坏样池。最终确定以5%的聚 丙烯酰胺凝胶作为最佳的胶浓度，凝胶透明、富有 弹性、孔径适中、操作容易、分辨力恰当、谱型清晰 (见图 2A，B，C)。

2.1.3电泳条件凝胶的厚度（间隔片的厚度)可 以介于0. 5~ 2mm之间，但由于凝胶越厚，电泳时 产生的热量越大，过热会导致出现“微笑”DNA条 带;过薄又不利于操作。因此，我们选用1mm作为 最佳胶浓度。电泳时采用55V低压过夜电泳的方 法，进一步防止高压产生热量，出现“微笑”带。用 此方法得到的分离结果DNA条带最尖锐、最平坦。 (见图 2A，B，C)。

2.1.4脱色、银染、显色过程Ag+与核酸形成稳 定复合物，然后用甲醛使Ag+还原成银颗粒。硝酸 银等试剂可使聚丙烯酰胺上的单链DNA染成黑褐 色。而且银染的灵敏度比EB高200倍左右[7]。由 于本实验使溴酚蓝前沿离开凝胶约0.5h，因而省去 了冰醋酸脱色和水洗的过程，使原来的1. 5h的脱

(低于删。1个交職的聚丙烯酰胺分子，色水洗、银染、显觸程咸少到0■ 5h。经过对比结

果相同。

2.2高浓度琼脂糖（2%)与适宜浓度聚丙烯酰凝 胶(5%)电泳的结果比较

两种材料利用同一引物经RAPD扩増后，对比 两种凝胶电泳结果可以看出聚丙烯酰凝胶优于琼 脂糖凝胶主要在两点：

2.2.1可以清晰地分辨相差10Cbp以下的片段 在琼脂糖凝胶电泳中，我们经常会遇到RAPD的扩 増结果出现拖尾、背景高、条带模糊等现象（见图 1A)，于是人们就致力于改变各种参数如模板 DNA、Taq酶、MgCl2和dNTP[1〇]或影响因素如循环 参数、PCR缓冲液及反应体积[11]对PCR扩増结果 形成影响，而本实验是从另一个角度，即改变电泳 方式，从而使未显现的条带显现出来。用比EB染 色更为灵敏的银染方式检测产物，得到了较好的分 离效果。如引物S2095、S2094、S1191、S1197的扩増 结果在2.0%的琼脂糖凝胶中形成了拖尾、具背 景、条带模糊等现象，但在聚丙烯酰凝胶中扩増结 果得到了很好的分离，这可能是因为筛孔小的琼脂 糖凝胶无法分离相差小的扩増条带。以引物S2095 在感病亲本和抗病杂交后代中的RAPD扩増电泳 结果为例：2 0%琼脂糖凝胶在1. 6、1.2、0. 9、0.8、 0.7kb左右各出现一条带，0.7kb以下带型模糊； 5%的聚丙烯酰胺凝胶除在1.6、1.2、0.9、0. 8、0. 7cb 左右出现条带夕卜，在1.9、1.3、0.88、0.83、0.6、 0.564、0. 1kb左右出现明显条带。

2.2.2分辨范围广2 0%的琼脂糖凝胶属高浓度 的胶，其有效分离范围是0.1~ 2kb[1]。但事实上 500bp左右的带型己不清晰。如引物S2096、S64、 S2084、1190(见图1B)。琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳技术检测，适宜浓度聚丙烯酰凝胶是 5%的胶，虽然它的有效分离范围是80~ 50Cbp[7]， 但在实验中发现，其在0. 08~ 2kb的范围内也能得 到很好的分离效果。因而，弥补了高浓度琼脂糖凝 胶的不足。实验证明，在80bp左右，银染过后条带 仍清晰可见。（见图2B)以引物S2096在感病亲本 和抗病杂交后代中的RAPD扩増电泳结果为例： 2.0%琼脂糖凝胶在2 2、1. 58、1. 1、0. 9kb左右各出 现一条带；5%的聚丙烯酰胺凝胶除在1. 58、1.1、 0.9、0. 5kb左右出现条带夕卜，在1.37、0.96、0. 94、 0. 83、0. 8、0. 7、0. 1kb左右出现明显条带，而且 0.5kb的带型在5%的聚丙烯酰胺凝胶上呈现出了 5%的聚丙烯酰胺凝胶在0.08~ 2kb的范围内都可 对线性PCR结果进行有效地分离，比琼脂糖凝胶

电泳具有更大的分辨力。

表1部分引物在两种凝胶系统中分辨力的比较

2. 0(%Vv) Agarose( kb)5(%V v) PAG( kb)5(%w/v)PAG 比 2.0 (%w/ v) Agaose 增 加的条带（条）有无抗感、 性差异

1.9

1.61.6

1.3

1.21.2

0.90.9

S20950. 88

0. 837无

0. 80. 8

0.70.7

0.6

0. 564

0. 1

1.581.58

1. 37

1.11. 1

0. 96 0. 94

S20960.90.99无

0. 83 0. 8 0.7 0. 56 0. 55 0. 1

1.71.7

1.481. 48

1.31.3

1. 25

S20910. 983有

0.90.9

0. 98

0. 84

0.7

2.3应用高浓度琼脂糖(2%)与适宜浓度聚丙烯 酰凝胶(5%)对白粉病抗感特性小麦品种检测的比 较

利用25个RAPD随机引物的PCR扩增结果进

行2 0%琼脂糖凝胶和5%的聚丙烯酰胺凝胶电 泳。发现聚丙烯酰胺凝胶电泳的DNA条带数目（6 〜14条)多于琼脂糖凝胶电泳（1〜8条）。其中17 个引物无论是2.0%琼脂糖凝胶电泳结果还是在

清晰的两条带，即a56和0■55kb左右的。很明显，5%的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果在感病亲本和抗病

杂交后代中扩增带型相同（如图2A, B, C),也就是胶电泳结果中，除1.7、1.48、1. 3、0. 9kb左右的条带

说没有发现DNA水平上的差异。但其中有8个引外,0.98、0.84、0.7kb左右有条带。值得注意的是

物，S2091. S2093. S1184, S1187, S377, S461, S465、 S1196在2. 0%琼脂糖凝胶电泳结果相同，即抗病 亲本和感病杂交后代的扩增带型相同，但在5%的 聚丙烯酰胺凝胶中带型出现差异，琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳技术检测，即抗病亲本和感 在0. 7kb处Brock抗病杂交后代出现一条明显条 带,而感病亲本京411中完全没有这条带,而这些 研究结果在用琼脂糖电泳方法检测时，没有显示出 差异。利用5%的聚丙烯酰胺凝胶分离扩增结果,

病杂交后代在DNA水平上出现差异。以S2091的由于其对小分子量DNA片段的分辨力强,可能会

扩增结果为例,2. 0%琼脂糖凝胶中，在1.7、1. 48、得到用2%的琼脂糖凝胶分离得不到的结果。

 

图1引物S2095( A)、S2096( B)、S2091( C)在抗、感品种间RAPD扩增的琼脂糖凝胶(2 0%)结果

 

图2引物S2095( A)、S2096(B)、S2091( C)在抗、感品种间RAPD扩增的聚丙烯酰胺凝胶(5%)结果

图 1、图 2 中加样顺序为 M: LambdaDNA/ECoRl + HindIIlMarker;1:京411;2:BC2F5

1.3、1.25、0. 9kb各有一条带,5%的聚丙烯酰胺凝胶。

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