是在 AFLP技术的基础上发展起来的一种实用的功能基因组研究方法[12]，可对生物体转录组进行全面、系统的分析;具有重复性高、假 阳性低、稳定、可靠等优点；且不需要预先知道序列信息，所需仪器设备也较为简单[3].聚丙烯酰胺凝胶电 泳是cDNA-AFLP分析的重要技术环节，但cDNA-AFLP选择性扩増产物的片段长度跨度较大，从几十个碱 基至近千个碱基.采用常规的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳往往造成底部条带之间的距离比顶部的大，致使胶 板的上部出现大片段条带堆积，而下部小片段条带间距过大，聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的改进及其在分析中的应用，能读出的条带数有限，从而影响了 cDNA- AFLP的分析效果.本研究在Sheen和Seed电解质梯度胶的基础上[4]，首次利用电解质梯度变性聚丙烯酰 胺凝胶电泳技术，对稻纵卷叶螟取食的水稻叶片进行cDNA-AFLP分析，得到的条带清晰、可辨，较好地满 足了 cDNA-AFLP等高通量分析对大分子分辨率的要求.

1材料与方法

1 1供试材料

11. 1植物材料水稻“明恢86”恢复系由福建农林大学遗传所提供，稻纵卷叶螟4龄幼虫采自福建农 林大学教学试验农场水稻田.

1 1 2试剂与仪器丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、尿素、过硫酸铵、四甲基乙二胺、防止粘胶均购自Amre- co公司;促使粘胶购自Amersham;冰乙酸、硝酸银、甲醛、无水碳酸钠、硫代硫酸钠均为国产分析纯.

三恒电泳仪（JY-ECP3000)为北京君意公司产品；电泳槽（DYCZ-20B型，25 cm x50cm)为北京六一仪 器厂产品.

12方法

1 2 1电泳样品的制备 cDNA-AFLP程序参照Bachem et al1]的方法进行设计.对稻纵卷叶螟4龄幼虫 

取食的水稻“明恢86”恢复系叶片提取总RNA;反转录成双链cDN人并用限制性内切酶AseI和TaqI切 割，将切割后的产物与cDNA-AFLP接头连接；以接头序列和相邻的限制性位点序列作为引物的结合位点. 采用PCR方法对目的序列进行扩増.取5UL选择性扩増产物与5UL上样缓冲液（loadhgbufer)混合，95 °C水浴5 mi^迅速取出样品置于冰上，立即点样，或将样品置-20 °C冰箱中存放备用.同时设空白对照.

1 2 2聚丙烯酰胺凝肢溶液的配制聚丙烯酰胺凝胶溶液的配制参照萨姆布鲁克等[4]的方法.质量分数 为45%的丙烯酰胺储液由434 g* L-1丙烯酰胺和16 g，L-1甲叉双丙烯酰胺按29: 1混配；10 xTBE由 108 g. L- 'Tiis碱、55 g. L-1硼酸和40 mL 0 5mol. L-1的EDTA组成.不同含量梯度的聚丙烯酰胺凝胶 溶液的配制见表1

12 3电解质梯度变性聚丙烯酰胺凝肢电泳表1不同含量梯度聚丙烯酰胺凝胶溶液的配制

Table 1 Dosage of the solation of polvraciylan ide gelwith different mass fractions

w聚丙烯酰胺凝胶45%质量分数的聚 丙烯酰胺储液/mL10 x TBE mL水/mL尿素/g

48 91045. 842

511 11043.042

613 31041. 142

817 81036.942

肢板的制作制胶玻板洗净后用酒精擦拭，晾 干.将300 UL促使粘胶涂到大玻板上，聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的改进及其在分析中的应用，将300 UL防止粘胶涂到小玻板上;将干净的垫片置 于大玻板的两侧，再用夹子将玻板夹紧;取50 mL的聚丙烯酰胺凝胶溶液置于烧杯中，加入 25UL的TEMED和1650UL的过硫酸铵，充

分搅匀后，用50mL的注射器吸取、灌胶，再将

鲨鱼齿梳子的平端插入玻璃板间约5mm;将嵌在丙烯酰胺凝胶中的鲨鱼齿梳拔出并清洗干净，同时用0 5x

TBE缓冲液冲洗拔出梳子的胶面，将梳子重新反向插入胶面中，鲨鱼齿梳深入胶中约1mm处.

12 4电泳在上槽加入0 5xTBE缓冲液;下槽加入1份NaAc( 3mol* L-〗洱=7 0)和2份1 xTBE 缓冲液，采用微量进样器（赶出胶孔中气泡）取5 UL处理好的样品点样后电泳.电泳条件：75W恒功率， 105 m in 1 2 5银染参照文献[5]的方法进行银染，将带胶的玻璃板放到固定液中轻摇40min取出玻璃板并回 收固定液，用去离子水冲洗玻璃板3次，再放入去离子水中轻摇10mh左右;取出玻璃板，用去离子水清 洗1次，聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的改进及其在分析中的应用，再放入质量分数为0. 1%的硝酸银染色液中轻摇30 min;取出玻璃板，用去离子水清洗10- 20 s 放入显影液中轻摇，直至出现清晰的条带;将回收的固定液倒入，终止显影，摇至气泡不再产生为止.

2结果与分析

2 1电解质梯度变性聚丙烯酰胺凝胶和普通变性聚丙烯酰胺凝胶的电泳效果比较

从图1可看出：用常规的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，胶顶部条带拥挤，大片段条带分辨率低;而用电解 质梯度变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，则顶部条带间距离较大，条带清晰，可分辨的条带数大大増加.

2 2不同含量电解质梯度变性聚丙烯酰胺凝胶的电泳结果

采用表1中不同含量的聚丙烯酰胺凝胶溶液进行电解质梯度变性聚丙烯酰胺凝胶电泳试验，结果表 明：质量分数为40%和80%的聚丙烯酰胺凝胶溶液的电泳效果较差，聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的改进及其在分析中的应用，质量分数为50%和60%的聚丙 烯酰胺凝胶溶液电泳效果较好（图2)，条带均较清楚.

3讨论

cDNA-AFLP分析过程中cDNA条带数越多，越容易找到差异表达的基因，以及从整体上揭示基因表 达谱对环境的响应.由于所采用的限制性内切酶在基因编码序列中的分布是随机的[67]，因此，采用一对 限制性内切酶切割双链cDNA后所产生的酶切片段的长度分布通常为几十个碱基至近千个甚至数千个以 上碱基.在常规的聚丙烯酰胺凝胶电泳条件下，聚丙烯酰胺凝胶电泳中DNA的迁移率与其片段的长度呈 对数关系，当小分子质量的DNA片段迁移至近胶底部时，顶部的条带还很拥挤（图1A)，且底部小片段间 距离太大.通过延长时间使顶部条带分开，会导致玻璃板温度过高，胶及玻璃板均容易断裂.而采用电解质 梯度变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶自身的含量不变，只是通过上下槽缓冲液时在胶中产生离子强度梯 度.由于通过凝胶的电压随离子强度的提高而降低，使胶底部电压降低，DNA接近凝胶底部时移动减慢， 底部条带间距离逐渐缩短，而顶部条带间距离逐渐拉开.利用此方法可使单块凝胶上能读取的DNA条带 数増加30%左右（图1B)，不需要常规变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中长达40min的预电泳，从而节约了大量 时间和能量.dm-AHP分析通常采用的凝胶的质量分数为晚，但从图2可看出在本试验条件下采用I

质量分数的凝胶分离几十至近千个碱基的DNA的效果更好.

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