聚丙烯酰胺凝胶银染技术改良：
聚丙烯酰胺凝胶银染技术改良，聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的DNA检测 方法，对于小于500 bp的DNA片段分辨率极高，长 度仅仅相差0.2 %(即500 bp中的1 bp)的DNA分子
也可被分开，且容纳的DNA量远远大于琼脂糖凝 胶。研究表明，从聚丙烯酰胺凝胶中回收的DNA纯 度极高，可适用于分子生物学中较高要求的实验(如 鼠胚微注射)[1〜3]。但其制备、操作繁琐，电泳结束 后染色过程也较为费时、费力。作者在工作中针对 变性与非变性两种聚丙烯酰胺凝胶银染方法各自最 适条件进行了探讨和改良，使之更加快捷、方便。
1材料与方法
1.1变性聚丙烯酰胺凝胶银染法选用80 g/L聚
丙烯酰胺凝胶(含变性剂的尿素)分离159〜196 bp DNA分子。电泳结束后，取出胶板，小心剥离并置
于固定液(含体积分数10 %乙醇，体积分数0. 5 %乙 酸)中轻摇固定3 min后，放入染色液（以固定液稀 释20 g/L硝酸银贮存液至2 g/L使用浓度)染色5〜 8 min，双蒸水漂洗2次，每次不超过2 min，显影液5 〜10 min至条带清晰后使用固定液定影10 min，双 蒸水漂洗数次即可。显影液为30 g/L氢氧化钠与 适当浓度甲醛的混合溶液，分别使用体积分数为 0. 2 %，0. 5 %及1. 0 %的甲醛，比较其显影结果。
*河南省医学科技创新人才工程项目（2000)84
1.2非变性凝胶银染方法选用80 g/L不含变性 剂的聚丙烯酰胺凝胶分离336 bp DNA片段。取出 胶板，入体积分数10 %乙醇轻摇固定5〜10 min，双 蒸水漂洗2次后置体积分数1 %硝酸5 min，双蒸水 漂洗2次，使用2 g/L硝酸银染色30 min，三蒸水洗 胶板2次，每次均少于1 min，入新鲜配制的显色液 (500 ml中含无水碳酸钠15 g，甲醛500 pl，硫代硫酸 钠5 g)轻摇直至条带出现，如需拍照，可将处于最佳 显色状态的凝胶入体积分数10 %乙酸终止显色。
实验过程中，分别使用常温下和4 n水预冷的显影 液进行显色。
2结果与结论
2. 1显影液中甲醛浓度对聚丙烯酰胺凝胶显色的
影响DNA经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，使用3种由 不同浓度甲醛配制的显影液后均出现相应条带，显 色速度随甲醛浓度增大而逐渐缩短。其中变性胶经 快速银染后以体积分数0. 5 %甲醛配制的显影液显 影效果为最佳，略显黄色，显色时间为7 min,相应条 带均清晰可见，对比度良好，适于拍照或进行计算机 图像分析。相比较,含体积分数为0. 2 %甲醛的显 影液显色所用时间较长，12 min左右出现结果，在 DNA条带出现同时，凝胶背底也逐渐加深,二者对 比较小。而体积分数1.0 %甲醛浓度显影液显影时 间明显缩短,3 min即可显色，聚丙烯酰胺凝胶银染技术改良，对于DNA带型，其相 互反差较小，层次感较差，因而分子量较小的DNA 不能同步显色，影响检测的敏感性。故认为,使用适 当甲醛浓度配制的显影液，对于增加聚丙烯酰胺凝 胶电泳敏感性与特异性将具有重要的作用。
2.2显色液温度对显色结果的影响作者分别使 用室温与4 C左右的显影液,显影效果以预冷的显 影液为最佳,其显色时间为10 min左右,DNA条带 清晰，反差明显，且背景较浅。聚丙烯酰胺凝胶银染技术改良，温度较高可以加快显 色速度,5 min出现条带,同时升高背景，提示显色液 温度的高低可影响显色反应的速度以及背景的 高低。
2.3变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染分析变性聚
丙烯酰胺凝胶电泳适用于微卫星位点杂合性缺失分 析。电泳后采用快速银染方法，所需时间少于30 min,同常规染色方法相比大大缩短了银染时间，显 影使用氢氧化钠,5〜10 min即可显示条带,优点在 于省时，便于及时固定分离DNA条带并银染直观观 察。操作过程中应合理控制漂洗及显影时间，及时 终止反应，否则胶板本底加深,对于进一步分析条带 产生影响。
2.4非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染分析非变
性聚丙烯酰胺凝胶电泳多用于DNA测序及单链构 象多态性分析,聚丙烯酰胺凝胶银染技术改良，不宜采用快速银染法,染色过程中尚 需注意：①所用试剂除显影液外均可多次回收使用， 倒液时应避免染色沉淀物接触胶板；②票洗过程中 尽量避免胶板置于空气的暴露时间过长，以防背景 过深,同时应使用双蒸水或去离子水充分漂洗；③显 影液应新鲜配制，使用前应冰浴至4〜8 C左右。该 染色方法具有条带清晰，背底浅等优点。
聚丙烯酰胺凝胶电泳为分子生物学实验中常用 技术之一。凝胶亦可采用溴化乙锭（EB)染色，经紫 外灯下观察,其优点在于操作简便，同时可直接切下 纯化DNA片段。但聚丙烯酰胺凝胶会熄灭EB荧 光，故不能检出少于10 ng的DNA分子，加之EB具 强烈神经毒性并污染环境，与之相比,银染法毒性及 污染小，并易于长期保存。目前已有学者[4]将需回 收纯化的DNA样品点样于相邻泳道,与银染条带对 应部位切下纯化,即解决了以往银染后DNA条带回 收纯化较复杂的问题，因而，聚丙烯酰胺凝胶电泳后 进行银染分析,必将在分子生物学领域得到更为广 泛的应用。而银染过程中样品DNA含量，染色液浓 度，时间,漂洗及终止时间的长短皆影响胶板的染色 深浅,在不同实验条件下应进行细心摸索，以期达到 最佳效果。
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