聚丙烯酰胺水凝胶对细胞的细胞毒性研究:
聚丙烯酰胺水凝胶对细胞的细胞毒性研究,聚丙烯酰胺属水凝胶类，是新型的医用高分子 材料。水凝胶是亲水性高分子在水中溶胀后，加入 适量的交联剂，得到的高含水的三维网状结构的水 膨润性凝胶(Hydrogel)。因为它们具有相当高的含 水量，在物理性质上柔软、富有弹性、橡胶般粘稠性， 与人体组织很相似。是近年来医用生物材料领域研 究的热点。聚丙烯酰胺是丙烯酰胺交联聚合制成的 水凝胶产品，因而对人体组织有良好的相容性和抗 凝血性能，己被制成人工血管、人工尿道等抗凝血材 料、各种吸放药物的凝胶剂等而得到广泛的应用。 1987年乌克兰率先将聚丙烯酰胺水凝胶作为软组 织填充剂应用于美容整形外科中，达到了良好的美 容效果。1997年该材料通过国家药品监督管理局 正式引进我国，并投入临床使用。1998年我国长春 富华公司也研制出同类产品。
但由于以往液体石蜡、硅凝胶等软组织填充材 料在临床应用中曾引起了严重的并发症[1~3,给人 们带来了惨痛的教训。因此对于聚丙烯酰胺是否能 作为软组织填充材料用于人体，目前争议仍很大。 本实验用四唑盐法比色法(M TT Assay )观察聚丙烯 酰胺水凝胶对L929细胞的细胞毒性作用，以期为 临床上安全使用提供科学依据。
1材料与方法 1.材料
1.1.1受试物进口聚丙烯酰胺(商品名英捷尔法 勒，简称IT,乌克兰生产）国产聚丙烯酰胺(商品名 富华软组织填充剂，简称FH,富华公司生产）
1.1.2细胞系鼠成纤维细胞L929细胞由本校 口腔生物学教研室提供。
1.1.3试剂RPM 1640培养液、胎牛血清(FBS)、 MTT,胰酶、二甲基亚砜(DMSO)、丙烯酰胺。
1.2方法步骤L929细胞复苏传代后，于对数生 长期，用0. 25 %胰酶消化后吹散，作细胞计数，用 1640调整细胞浓度至0. 2X 105个/ml。用微量移 液器以100W/孔置于96孔板中复种4 ?L，在5% CO2、37°C标准环境下以含10%FBS的1640孵育。
阳性对照用0.7%丙烯酰胺交换，实验 组分别用2倍浓度的培养液和H2〇稀释IT及FH 至50%、25%和12.5%,每孔2004交换，然后置入 培养箱中继续培养。分别于第2天、4天及6天各 取出一块培养板，每孔加入20W的MT T溶液，继续 培养4 ~ 6小时，然后，弃去孔内液体吸出聚丙烯酰 胺水凝胶。每孔加入150ul DMSO。振荡10分钟， 用酶联检测仪在490nm波长检测光吸收值（OD)， 取4孔平均值。按照下列公式计算相对増殖率 (Relative growth rate, RGR)4]。
RG R=实验组吸光值x 100 %
RGR=寸照组吸光值100 %
然后根据RGR值按以下标准评分定出材料的
毒性级别： 评分相对增殖率（％)
0级>100
1级75 〜99
2级50 〜74
3级25 〜49
4级1〜24
5级0
2结果
2.1相差显微镜观察3种不同浓度的两个受试
物组在加药后第2、4、6天的细胞形态与阴性对照组 细胞形态基本相同，聚丙烯酰胺水凝胶对细胞的细胞毒性研究,呈梭形或三角形，贴壁良好，生 长旺盛。阳性对照组细胞在加药后第2天有近1/3 死亡，余下的细胞贴壁生长不良，细胞圆缩。第4天 时90%的细胞死亡。
表1国产及进口聚丙烯酰胺水凝胶及对照组的吸光值(OD) x±s
材料2日吸光值4日吸光值6日吸光值
聚闪烯酰胺浓度x 士 sx 士 sx 士s
空白对照组0.58±0.011 60士0 071 97 士0 09
IT112. 50.56 士 0.081.46 士 0. 131 79 士0 09
IT2250.54 士 0. 121. 33 士 0.071 76 士0 07
IT3500 .52士0 .021. 36 士 0.031 79 士0 13
FH112. 50.57 士 0.071 35士0 061 80 士0 08
FH2250 55士0 181. 39 士 0. 141 76 士0 11
FH3500 52士0 201 40士0 081 90 士0 08
阳性对照0.22 士 0.030. 14 士 0.030 05 士0 04
聚丙烯酰胺各组之间及与阴性对照组比P> 0. 05,阳性对照与阴性对照组比0. 01
表2相对增殖率及毒性评分
材料2日吸光值4日吸光值6日吸光值
聚丙烯酰胺浓度（％)RGR评分RGR评分RGR评分
空白对照组100010001000
IT112 596 6191 2190 91
IT22593 1183 1189 31
IT35089 7185190 91
FH112 598 3184 4191 31
FH22594 8186 9189 31
FH35089 7187 5196 41
阳性对照0 737 938 7542 534
3讨论
31关于MTT法目前，世界上己有多种细胞毒 性试验方法被应用于医学材料的毒性评定，如琼脂 覆盖法，同位素标记法(51心-、3只、125^4只)，分子滤过 法，细胞増殖度法，细胞形态观察法及细胞图像分析 仪定量法等5。1983年Mosmann[6]首次报道了 一' 种新的快速评定细胞増殖和细胞毒性的比色分析法
MTT试验法。1987年Twentyman[?l等报道
用MTT检测细胞活性，并认为可以代替活细胞计 数、同位素标记法进行细胞毒性试验。MTT是一种 能接受氢原子的染料，化学名为3 —（4 5 —二甲基 噻唑一 2)—2.5—二苯基四氮唑溴盐，商品名为噻唑 蓝。其原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使 外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物，并 沉积在细胞中，而死亡细胞无此功能。DMSO能溶 解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在 490nm波长处测定其吸收值，可间接反映活细胞数 量。由于结晶物形成的量与细胞数量及其活性成正 相关，聚丙烯酰胺水凝胶对细胞的细胞毒性研究,通过比色、测定光吸收值(OD)，可计算出各实 验组细胞相对増殖率，即可反映出细胞的数量及其 活性。该方法灵敏度高、重复性好、操作简便、经济、 快速，无放射性污染，与细胞计数和核素掺入等方法 有良好的相关性[8,故我们采用了此方法。MTT 实验结果显示:加入3个浓度的进口与国产聚丙烯 酰胺水凝胶的L929细胞在培养2日、4日、6日的 MTT结晶显示：国产聚丙烯酰胺与进口聚丙烯酰胺 两者及它们各自3种不同浓度的MTT结晶形态 上，数量上无明显区别，与所测的OD值相符，但随 着培养时间的延长，MTT结晶不断増多，这一点也 是符合L929细胞的増殖规律的，也与我们所测的 OD值相一致。
3.2关于聚丙烯酰胺的毒性医用聚合物材料一
般要同体液相接触，聚合物本身通常是没有毒性的， 聚丙烯酰胺水凝胶对细胞的细胞毒性研究,引起炎症和组织反应的主要原因是聚合物中的易溶 出物质。这些易溶出物质一般包括残留的原料单 体、低分子聚合物、催化剂和其它添加剂等等。动物 试验虽可反应出医用聚合物溶出物的毒性情况，但 要定量地考察出聚合物溶出物对生物的影响则是比 较困难的。而体外细胞培养精确性、敏感性均较高， 有可能大量提供在同一时期、条件相同、性状相似的 实验样本[8]，既可减少在哺乳动物身上进行的聚合 物材料模拟实验的昂贵费用，又能避免因动物来源 不同而造成的影响。因而可用体外细胞培养来评价 聚合物中可能存在的低分子量的物质及聚合物中可 溶出物的细胞毒性影响。
本实验采用标准的成纤维细胞株L929在三个 浓度组份的进口及国产聚丙烯酰胺培养液中用倒置 显微镜及MTT法观察比较结果显示，各个浓度的 IT和FH对L929细胞未发现对细胞生长有抑制作 用，对细胞形态亦无明显影响。IT、FH相对増殖速 度较大，均属RGR分级标准1级，几乎没有毒性，判 为合格，显示了国产及进口聚丙烯酰胺作为软组织 填充材料有较好的安全性。聚丙烯酰胺水凝胶对细胞的细胞毒性研究,且国产聚丙烯酰胺与进 口产品相比未见毒性上明显差异，安全指标上达到 同类进口产品要求。实验中所见细胞在加有聚丙烯 酰胺的培养液中贴壁生长良好，可能是由于聚丙烯 酰胺在性质上相当于细胞间质，支持了细胞的生长。 据报告1967年乌克兰的微生物学家和细胞学家应 用聚丙烯酰胺水凝胶作为细胞培养基，同时证明该 种材料对细胞无毒性，微生物和细胞可在该种材料 内生长和分裂。这一结论还有待进一步实验证实。
本文推荐企业：山东东达聚合物有限公司（http://www.sdpamchina.com/)，是专业的阴离子聚丙烯酰胺，阳离子聚丙烯酰胺,聚丙烯酰胺生产厂家，专业生产聚丙烯酰胺,阴离子聚丙烯酰胺,阳离子聚丙烯酰胺,非离子聚丙烯酰胺。拥有雄厚的技术力量，先进的生产工艺和设备。东达聚合物有限公司全体员工为海内外用户提供高技术,高性能，高质量的聚丙烯酰胺产品。专业聚丙烯酰胺生产厂家：山东东达聚合物有限公司热忱欢迎国内外广大客户合作共赢。