生命科学和医学领域经常需要对生命过程以 及病理生理过程中的某种基因进行表达水平上的 研究，PCR技术的问世为此带来了便利。利用PCR 技术对生命过程中某种基因表达量变化的分析经 历了一个从相对定量到绝对定量的过程，荧光实时 定量PCR仪的问世，使定量技术达到了一个新的 高度，实现了 PCR从定性到定量的飞跃，但是，由 于荧光实时定量PCR仪价格昂贵，限制了该仪器 在研究中的推广使用。

事实上，在许多研究过程中只需评估样品之间 某种基因表达水平的相对差异，半定量RT-PCR技 术完全可以满足上述目的的研究。现阶段很多实 验室常用的半定量方法为:在进行PCR扩増后，采 用琼脂糖凝胶电泳检测实验结果，根据电泳条带的 亮度来反映目的基因的丰度。由于该方法检测的 灵敏度较低，常需要较多的循环数（>30个循环)， 而此阶段为PCR扩増的平台期，PCR产物量与起 始模板（目的基因)量己不呈线性关系，难以反映目 的基因的起始模板量，实验结果往往出现很大的 偏差；降低循环数则因在琼脂糖凝胶中难以检测而 导致实验的失败。因此，寻找一种高灵敏的产物检 测方法是目前进行目的基因表达差异研究的关键。 DNA银染技术目前主要用于差异显示研究，其检 测的灵敏度接近于同位素检测，可达到5~ 10 pg/ mm2水平[2,'结合定量PCR技术研究，有望为基因 表达水平的研究提供可靠的实验结果，目前，还没 有发现相关的研究报道。

本研究将聚丙烯酰胺凝胶电泳技术、银染技术 和RPPCR相结合，以fractin基因作为内参照，通 过己知的正常组大鼠和链脲佐菌素致糖尿病模型 组大鼠心肌组织中葡萄糖转运蛋白4&^〇*^腿- poiteis IV，Glu T4) mRNA水平上的差异，研究PCR 扩増循环数和起始模板量对半定量PCR分析结果 的影响，探讨利用常规PCR技术进行定量分析的 最佳实验条件。

1材料与方法

1.1实验动物

SD大鼠，雄性，体重（200 ±20) g，购自南京医 科大学实验动物中心，合格证号:SCXK(苏)2002- 0015。

1.2试剂

M-MLV 逆转录酶、RQ1 RNas-fi.ee DNase I 为 Pomega公司产品;Taq DNA聚合酶、RNasin和锚定 引物Oligo ( dT)18为上海生物工程技术服务有限公 司产品；其余试剂均为国产分析纯。

1.3引物

葡萄糖转运蛋白4引物序列为:上游引物5^ AGCCAGCCTACGCCACCATA 3(Td= 69. 6 °C)，下游 引物 5 GGACCCATAGCATCCGCAAC 3 (Td= 69. 1 °C)，内参照fractin的引物序列为：上游引物兮 CTTCCAGCOTCCrTCCrGG3 (Td= 67.8 °C)及下 游引物 5^ TTGCGCTCAGGAGGAGCAAT 3 (Td = 69.8 °C)，均由上海申友生物技术有限责任公司合 成。

1.4仪器

GeneAmp PCR System 2400 为 Applied Biosystems 公司产品；GDS 8000 White/ Ultraviolet Transillumin;— tor•为UVP公司产品。

1.5动物模型的建立及实验材料的获得

SD大鼠30只，按60 mg/kg ip链脲佐菌素造 模，聚丙烯酰胺凝胶银染技术在半定量中的应用，给药体积为10 ml/kg; 2周后尾静脉采血，用 Lifescan稳捷型血糖仪测定其血糖值，以血糖值> 16. 7 mmol/L为造模成功标准;正常饲养2个月后， 分别取模型组大鼠与正常组大鼠心脏，液氮速冻后 于-70 °C低温冰箱中保存备用。

1.6总RNA的提取及逆转录

总RNA提取参照Chomczynski报道的酸性异 硫氰酸胍一步法，以无RNase的DNase消化去除 总RNA中残余的DNA后，测定总RNA的OD260/ OD280以判断总RNA的纯度，以ODM)计算总RNA 含量，并通过甲醛凝胶电泳鉴定其完整性；逆转录 体系总体积为 20 W:含 10 mmol/L Tri-HCl(pH 8. 3)、15 mmol/ L IKCl、0■ 6 mmol/ L MgCl2、2 mmol/ L DTT、1. 25 mmol/ L dNTPs、20 pmol 锚定引物及 5 Ug 总RNA，经70 °C水浴5 min热变性后加入40U RNasin、200U M—MLV 逆转录酶，37 °C温育 1.5 h， 沸水浴10 min以灭活逆转录酶，-20 °C冻存备用。 1.7 不同循环数PCR扩增

100 Ul PCR 扩増体系包含：10 mmol/L Tri-HCl (pH 8. 8)、50 mmol/ L KCl、2. 5 mmol/ L MgCl2、0■ 5 mmol/ L dNTPs、Glu T4 引物及 l-actin 引物各 62 5 pmol、5 U Taq DNA 聚合酶、1. 0 Ug cDNA 第一链;94 °C热变性3 min后进入PCR循环，PCR扩増参数如 下:94 °C变性 30 s，62 °C 退火 30 s，72 °C延伸 30 s， 共35个循环，最后于72 °C延伸10 min;分别于第 12, 16,20, 25, 30, 35个循环时各取样15 R备用。

20 Ul 扩増体系包含：10 mmol/L Tri-HCl(pH 8. 8)、50 mmol/ L KCl、2. 5 mmol/ L MgCl2、0.5 mmol/ L dNTPs、Glu T4 引物及&actin 引物各 12. 5 pmol、1.0 U Taq DNA 聚合酶、分别加入0■ 4, 0■ 8, 1. 2,1. 6, 2.4 Ug cDNA第一链;94 °C热变性3 min后进入PCR循 环，PCR循环参数如下：94 °C变性30 s，64 °C退火 30 s，72 °C延伸30 s，共25个循环，最后于72 °C延 伸 10 min。

1.9聚丙烯凝胶电泳及银染

扩増后的PCR产物用6%变性聚丙烯酰胺凝 胶电泳检测[3]，聚丙烯酰胺凝胶银染技术在半定量中的应用，凝胶板面积为160 mm x 160 mm，胶 厚度为1 mm;上样前预电泳30 min，并将样品80 °C 热变性5 min，上样后以150 V电泳至二甲苯到达 凝胶3/4处终止电泳;将聚丙烯酰胺凝胶用H2O洗 涤后，置于10%乙酸中固定20 min，H2〇洗涤3次 后，加入染色液（1.0% AgN〇3/0. 0555%甲醛）染色 30 min，dH2〇洗涤20 s后加入显色液（3. 0% Na2C〇3,0■ 0555% 甲醛，2.0 x 10- 6% Na2S2〇3)显色 直至有清晰的条带出现后，用10%乙酸终止反应， 用凝胶图象分析系统对电泳结果进行扫描分析。

2结果

2.1动物模型的建立

造模两周后，模型组大鼠的血糖升至18.76 士 1.96 mmol/L，与正常组比较具有显著性差异（表 1)，说明造模成功。

Tab 1. Ei^ect of streptoa^tocin on the level of blood glucoserats( n = 8)

GroupsBlood glucose(mmol/L)

Normal4 01 ±0.50

Model18 76±1.96**

The rats of model group were administrated with streptozotocin (ip). The level of blood glacose in rats of the model and normal group were mea¬sured 2weeks after injecting streptozotocin. * * P< 0. 01 vs normal group

2 2 总RNA纯度分析

总 RNA 经 RQ1 RNA~free DNase 处理，用 1. 0% 甲醛变性凝胶电泳，可见清楚的28S、18S条带，而 且28S/ 18S的比值约为2: 1(图1)，表明RNA完整 性较好。其中，模型组和给药组总RNA的ODM/ OD280比值均在1. 8~ 2. 0之间，表明纯度较高。

不同循环数对PCR扩增产物的影响

用聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染技术对不同循 环数PCR扩増产物进行了分析(图2),并利用凝胶 图象分析系统和LabWork 4. 0软件对扩増结果进 行了扫描分析(表2)。

从图2及表2中可以看出：当PCR扩増反应进 行到第16个循环时即可利用聚丙烯酰胺凝胶电泳 和银染技术检测到产物的存在；当PCR扩増反应 进行到第20个循环时，模型组大鼠心肌组织Glu T4基因片断扩増产物量与内参照Hactin基因片断 扩増量的比值为0.22,而正常组此比值为0. 31，模 型组与正常组大鼠心肌组织Glu T4基因片断扩増 产物量己显示出明显的差异，即：糖尿病模型组

Glu T4 mRNA的表达量相对于正常组大鼠下调，与 报道的情况一致16];在30和35个循环中，模型组 GluP4/f-actin的比值与正常组此比值的差异变小，

并趋于一致。

 

Fig 2 RT-PCR products at differential cycles a^ialvzed with polyaciylamide gel elertiophoresis

Lane1: DL2000 DNA marker; Lane 2, 4, 6，8，10，12: indicate respectively the results of normal group' s PCR product at the 12，16, 20, 25, 30, 35 th cycle;Lane 3，5，7，9，11，13: indicate respectively the results of model

group’ s PCR product at the 12，16, 20, 25, 30,35 th cycle

由上述分析，我们初步确定25个循环数为半 定量PCR分析中采用的最佳循环数，聚丙烯酰胺凝胶银染技术在半定量中的应用，并比较了银 染方法和EB染色方法对25和30个循环的PCR产 物的检测效果，发现EB染色的方法不能检测到25 个PCR循环的产物（图略)。 

Tab 2. Expression level of Gla T4 a^id actin gene of rats in the normal a^id model groups

Cycles of PCR121620253035

N MNMNMNMNMNM

Glu T4( %)- ---12. 39 8420.811.316 617 214. 112. 5

£-actin( %)--16 818 439. 645.342.534.723 127 718. 316. 9

Glu T4/£-actin- ---0 310 220. 490.330. 720. 620 770 74

The expression level of Glu T4 and 3-artin gene of rats in the normal and model groups were analyzed by LabWork 4. 0• N: normal group;M:model group

 

2. 4起始模板量对定量分析的影响

根据“2. 3”项的分析结果，我们确定了定量分 析中的PCR扩増循环数为25个循环，并以此分析 了不同起始模板量与产物量之间的关系。

在20 Ul PCR扩増体系中分别加入0. 4, 0. 8, 1.2, 1. 6, 2. 4作逆转录产物，经过25个循环，Glu T4与!-actin的扩増产物量均随模板量的増加而増 的线性关系（图3及表4)。

3讨论

匍萄糖转运蛋白 4( glucose transporters IV，Glu

加，且Glu T4/f-actin的值与起始模板量呈现较好细胞中的表达下调，从而减少葡萄糖的跨膜转运，影响心肌细胞的能量代谢过程，并最终引起糖尿病心 肌病。本研究根据上述稳定的病理模型，探讨了 半定量PCR方法在病理分析过程中的应用，并对该 方法在病理分析中应用的条件进行了优化。

本研究属于多重PCR的范畴，Mullis等认为： 就多重PCR的研究而言，聚丙烯酰胺凝胶银染技术在半定量中的应用，较高的模板量、Mg2+以及 dNTPs均有助于多重PCR的成功11]。因此，我们在 本项研究中采用的Mg2+为2 5 mmol/ L, dNTPs浓度 为0. 5 mmol/L,均高于普通PCR反应，并取得了良 好的扩増效果。

就定量分析而言，要使PCR产物量能够较好 地反映起始模板量，必须对处于指数扩増阶段的产 物进行检测，而它是不能通过EB染色检测到的， 这是在利用常规PCR方法分析目的基因表达变化 过程中常遇到的难题，大多数实验室常将定量分析 过程中的PCR扩増循环数提高到30甚至35个循 环，但是，往往导致实验失败，因此，寻求一种高灵 敏度的检测核酸数量变化的方法是关键。常用于 低丰度核酸检测的方法是同位素方法，但该方法易 污染、周期长以及需要特殊设备，限制了它的应用； DNA银染技术则是另外一种高灵敏度的核酸检测 方法，与同位素方法相比，其克服了同位素法的不 利因素，检测灵敏度与同位素法相当，达到检测5 ~ 10 pg/mm2核酸水平[2]，目前该方法己被广泛应 用于mRNA差异显示的研究中，但尚未发现在 DNA(或mRNA)定量分析中应用的报道。

I 2 3 4 5 ^

2(KK)-^ ^

 

25(i— ^

Fig 3 Result of polyacrylamide gel electrophoresis of Ri-PCR products with differential quantities of templates

Lanel: DL2000;Lane 2, 3, 4, 5, 6: indicate respectively the results of PCR with different quantities of template at the 25th cycle 

Tab 3. Effects of different quantities of template on the quantities of PCR pioducts( n= 3)

GroupsTemplate(Ug/Ul)

0.40 81. 21.62 4

Glu T4-2.21 + 0. 603. 28±0 404. 10 ±0. 437 51 ± 0.59

f—actin11. 11 ±4.3316.35+2. 0317. 52 ± 2 1618.91 ±2. 5020 85 ±2. 32

Glu T4/ £-actin-0. 13+0. 020. 19 ± 0 010.22 ±0. 010 36 ± 0.02

The quantities of PCR products will different quantities of template were analy疋d at the 25th cycle by LabWork 4 0

 

在PCR扩増循环数确定后，需要考虑扩増体 系中的起始模板量对最终分析结果的影响。我们大小的差异。因此，我们认为，在对它们的丰度大

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染技术，我们对 不同循环数（12~ 35)的PCR产物进行了分析，发 现在第12个循环时即可检测到PCR产物的存在， 这是EB染色方法所不能达到的，根据对扩増动力 学的研究，12~ 25个循环内，PCR扩増仍处于指数 扩増期，因此，在此循环数范围内，可以较为准确地 通过比较产物量来判断起始模板量的差异，但是， 考虑到凝胶图象分析系统检测的灵敏度，我们建议 在进行DNA(或mRNA)定量分析时，将循环数控制 在20~ 25个循环以内，以保证分析结果的稳定性 和可靠性。

分析了 0. 8~ 2.4 Wg模板量对分析结果的影响，结 果证明：聚丙烯酰胺凝胶银染技术在半定量中的应用，在此范围内，目的基因GluT4与内参照基 因f-actin的扩増产物量均随模板量的増加而増 加，且Glu T4/&actin的比值与起始模板量呈现较 好的线性关系，起始模板浓度可以较为准确地通过 产物量来反映。

在进行目的基因的定量分析过程中尚需考虑 目的基因和内对照基因的丰度、大小以及它们的引 物长短对扩増反应的影响，Mullis等认为内对照基 因的丰度与目的基因的丰度不宜相差太大[1]，否则 会影响到分析的准确性，但是，在分析过程中往往 很难兼顾到不同时期目的基因与内对照基因丰度 小判断比较困难的情况下，可以考虑选择细胞中组 成型表达的基因作为内对照基因，如:f-actin以及 GDPH等，由于这些基因的表达一般很少受到其它 因素的影响，因此，可以在一定程度上直接反映细 胞内的状态。我们以f-actin为内对照基因并获得 了较为满意的结果。到目前为止，还没有发现关于 目的基因与内对照基因的大小差异对定量分析结 果产生影响的报道，一般在进行分析的过程中仅考 虑到两者的差异可以通过电泳检测即可，为便于在 凝胶中的检测，建议两者间的差异最好介于100~ 400 bp间，该差异可以通过PAGE胶或2.0%的琼 脂糖凝胶进行检测；目的基因和内对照基因的引物 长短和碱基组成对半定量分析的结果影响较大，聚丙烯酰胺凝胶银染技术在半定量中的应用，由于两对引物是在同一个扩増体系中进行PCR反 应，因此，两引物的长短和碱基组成最好相近，即引 物应具有相似的Td值，本研究中选择的Td值为 (68. 8 ± 1.0) °C，保证了扩増条件的一致性。

本研究仅就Glu T4基因在糖尿病发生过程中 表达的变化进行了分析。

总之，在一定的起始模板量范围内，将PCR扩 増循环数控制在25个循环以下，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染技术，可以利用PCR方法较为准 确地研究目的基因的表达水平。