凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶（PAGE)电泳技术。 Southern杂交由于步骤繁琐、耗时长和同位素放射性 污染等缺点，在_般实验中使用较少;琼脂糖凝胶电泳 技术以其操作简单、耗时短而被广泛使用，但琼脂糖凝 胶电泳却无法分辩差异小的DNA片段;PAGE电泳是 _种常用的DNA检测方法，是聚合酶链式反应、单链 构象多态（PCR-SSCP)分析中不可缺少的技术,广泛应 用于遗传育种、基因定位、种子活力测定等研究领域， 对于<500 bp的DNA片段分辨率极高，只相差1 bp 的片段也能分开,且可容纳相对大量的DNA。研究表  

明，从PAGE中回收的DNA纯度极高，可适用于分子 生物学中要求较高的实验M。

BassamPAGE胶显带的常规方法，电

泳完毕后，首先用固定剂将核酸或蛋白固定到凝胶上， 然后使银染剂中的银离子与之牢固结合，再通过还原 剂将银离子还原，从而发生银棕色显色反应。然而，实 验中常会出现各种问题，如胶破裂、背景太深、无DNA 带或带纹不清晰等，它们与银染过程中药品使用浓度 和时间有密切关系。PAGE胶显带的常规方法操作繁 琐、耗时长，改进的银染法可降低成本，提高效率。

1 PAGE电泳影响因素

1.1 PAGE交联度和浓度

高交联度（丙烯酰胺：N,N'-亚甲双丙烯酰胺为 39 :1)的PAGE电泳条带清晰，没有多余的细小条带， 低交联度（丙烯酰胺:N,N'-亚甲双丙烯酰胺为19 :1) 的PAGE可能出现与PCR产物中与目的条带相近的 细小条带（俗称影子带），若对目的条带不是很了解, 则不利于基因型的判断0。

核酸PAGE电泳根据所分离的DNA片段长度需 配制不同浓度的凝胶，一般在3.5% ~20. 0%。在其 他条件相同时，条带相近的PCR产物在高浓度的 PAGE电泳中条带更易压缩，更易分开,而在低浓度的 PAGE中占的体积大，条带较弥散，不易分开，不利于 基因型的判断;在低浓度中，同一电泳道中的多个条带 之间的绝对距离较高浓度的绝对距离要远，有利于基 因型的判断17];低浓度凝胶较高浓度凝胶显色更快。 很多试验结果表明，用6%的凝胶分离所选标记片段, 可提高分辨率1。

1.2几种药品的影响

(1)过硫酸铵。过硫酸铵可引发丙烯酰胺单体发 生链式反应，聚合成长链，加入交联剂甲叉双丙烯酰胺 后，链链之间交联成交联体。一般29分子丙烯酰胺单 体聚合成1分子交联体&]。灌完胶后，剩余胶一般5 min后显示聚合。如30 min不凝固，则胶聚合效果不 好，可能是过硫酸铵质量不好或量少，胶板易黏胶而破 胶。如5 min以内就开始凝固，则过硫酸铵过量，会导 致梳子插入和气泡清除困难;再则过多的过硫酸铵影 响电泳,DNA带发虚、扭曲。为了减少过硫酸铵对电 泳的影响，一般需先进行30 min的预电泳。

(2)冰醋酸。又称乙酸，是具有刺激性气味的无 色液体。在银染过程中冰醋酸主要起到两方面的作 用，即固定和停显。将电泳的DNA片段固定在测序胶 中，除去电泳缓冲液和凝胶中的尿素，并防止小的延伸 产物的扩散。感光材料在酸性溶液中终止显影过程。

(3)硝酸银。硝酸银是无色透明片状结晶颗粒, 其溶液中的银离子可与核苷酸中带负电的磷酸基团共 价结合,并在碱性环境条件下，由甲醛还原成黑褐色的 金属银沉积于胶中而显示DNA带型°8。聚丙烯酰胺凝胶电泳银染的影响因素，在染色时，应 待硝酸银完全溶解并混匀后才将胶放入，否则银颗粒 会潜入胶中，使背景杂乱。硝酸银量不足会使DNA带 变浅、失效，导致胶板变空白；量过多，导致嵌入或残留 在胶板上的银离子增多，背景深而影响显带。同一浓 度硝酸银染色时间在30 ~40 min,显色时间及显色结 果无差异，当染色时间少于30 min,显色时间需相应延 长。0.2%硝酸银比0. 1%的硝酸银显带更深、更快、 灵敏度更高9]。

(4)甲醛。甲醛溶液是一种无色、有强烈刺激性 气味的液体。在含硫代硫酸钠的碱性碳酸钠溶液中甲 醛溶液将银离子还原为金属银而显色。当甲醛浓度较 高时，染色时间缩短,但胶颜色发黄，背景污浊，且相互 反差变小，使不同相对分子质量的DNA不能同步显 色,影响灵敏度;浓度较低不仅染色时间延长而且不易 着色。由于甲醛在室温时极易挥发，往往在实际操作 中甲醛溶液浓度不足。在不同浓度的凝胶中，使用适 当浓度甲醛配制的显影液。甲醛浓度在0. 1%、 0.15%2% (体积比）范围内显色差异不大°9 ,如果 过高，则显色速度加快，显色程度难以控制°°。

(5)无水碳酸钠和氢氧化钠。无水碳酸钠是白色 粉末状碱性物质。在显影液中提供碱性环境，促进显 影剂显影。实验中，无水碳酸钠溶液提前在4°C条件 下预冷，这样可以延缓显影时间，便于控制显影过程及 中止反应时间，同时减少背景着色。用氢氧化钠代替 无水碳酸钠或提高碳酸钠的浓度，可以使显影时间缩 短，但背景颜色加深。1.5%和3%氢氧化钠显色结果 无差别,背景均较黄。

(6)硫代硫酸钠。硫代硫酸钠是无色棱状晶体。 作为银的络合剂作用是当银离子与核酸中带负电的磷 酸基团等结合后与过多的游离银离子形成可溶性络合 物。在定影过程中硫代硫酸钠防止自由银离子还原为 金属银，减少非特异染色,以防背景加深。硫代硫酸钠 量过多胶颜色发黄，过少则不足以螯合掉游离的银离 子，胶颜色发黑。一般10 mg/mL的硫代硫酸钠用量 为 100 ~200 pL/L。

1.3显带方法

(1)弱碱银染法M。①固定:从垂直板电泳槽 上，取下PAGE胶板并撬开，将带胶的平板玻璃放入 10%的冰醋酸固定液中缓慢水平摇动30 min左右，以 指示剂消失为准。固定结束后，固定液可作为定影液 留用。②漂洗：放入双蒸水中漂洗胶版3次，每次2 min。③染色:放入0. 1%硝酸银染色液（2 g硝酸银 + 2 000 mL双蒸水+3 mL甲醛溶液）中缓慢摇动染色 30 ~45 min。④漂洗:将胶板放入双蒸水中冲洗不超 过20 s,迅速取出控水。⑤显影:取出4C预冷的显影 液（60 g无水碳酸钠+ 2 L双蒸水），加400斗 (10 mg/mL)硫代硫酸钠溶液和3 mL甲醛溶液 (37%),充分混匀。将胶板放入，缓慢摇动，直到条带 全显现为止。⑥定影:将胶版放入定影液中缓慢摇动 2 min。定影液配方和固定液一样。⑦漂洗:从定影 液中取出胶,在清水中漂洗3次,室温晾干即可读胶。

(2)强碱银染法M。①固定：将平板放入固定 液（1 790 mL双蒸馏水+200 mL无水乙醇+ 10 mL冰 醋酸）缓慢水平摇动15 min左右,以指示剂消失为准。 固定液可多次利用。聚丙烯酰胺凝胶电泳银染的影响因素，②漂洗：用双蒸水漂洗凝胶2 次，每次2 min。③染色:胶版放入0.2%硝酸银染液 (2 L双蒸馏水+4 g硝酸银）中缓慢摇动染色12 min。 ④漂洗：将胶板放入蒸馏水中冲洗5 s,迅速取出控 水。⑤显影:把凝胶放入显影液(2 L双蒸馏水+30 g 氢氧化钠+6 mL甲醛）中，缓慢摇动直到条带显现为 止。⑥定影:将胶板放入定影剂中2 min。⑦漂洗: 用蒸馏水漂洗胶板，置于室温下自然凉干。

(3)简易银染法M。①漂洗：将带胶的玻璃板 放入双蒸水中漂洗15 s。②染色:胶版放入0.1%硝 酸银中染色8 ~10 min。③漂洗:用双蒸水漂洗2次， 每次洗10 s。④显影:将胶板放入显影液（30. 0 g氢 氧化钠+ 2 L双蒸水+6 mL甲醛）中，密切观察显影效 果和背景的深浅。⑤漂洗：当带已经清晰显出后，将 胶版放入双蒸水中漂洗2次,室温晾干即可读胶。

(4)简易快速银染法。①染色:从垂直板电泳槽 上取下胶板并撬开，将带胶的玻璃板放入染色液 (10%乙醇+0.5%乙酸+0.2%硝酸银）中染色5 min。 ②显影:将控干染色液的胶版放入显影液中（3%氢氧 化钠+0. 5%甲醛）显影直至显带，室温晾干即可 读胶M。

(5)几种显带方法比较。弱碱银染法染色背景浅 带型清晰，强碱银染法带型清晰但背景深;弱碱银染法 每次染色需重新配固定液、显影液、染色液，成本较高， 强碱银染法染色液可以回收重复利用，固定液也可多 次利用，成本较低;弱碱法对每一步要求比较严格，要 求操作人员有一定的经验，它在显影时显影液需预冷， 显影效果受温度影响大，在显影过程后期显影速度很 快，它要求带型显出时及时终止反应，如把握不当，染 色背景将迅速加深，染色效果极差，弱碱法稳定性较 差，强碱法显影过程比较温和，当把凝胶放入显影液 中，最初5 min无明显变化，在以后的10 min逐渐显出 带型，当带型都显出来后，背景颜色基本不变，显影容 易控制，稳定性好。对于扩增很好的PCR产物，采用 弱碱法，由于背景较浅，DNA带型会很清晰。但如果 对于那些扩增差的PCR产物，弱碱法效果较差，而强 碱法能够提高DNA带型和背景的对比度，使得DNA 带型较清晰，因此,强碱银染法比弱碱银染法具有更高

的分辨率M。

简易银染法和简易快速银染法是在强碱法基础上 的改进方法。简易银染法较常规显带方法节省，操作 更为方便，从时间上看，银染只需10 min,随后即显影， —般只需15 min即完成DNA的显带过程，其速度之 快可与琼脂糖凝胶电泳结果相比。从步骤上看，采用 改进的方法比常规显影方法少了固定和定影等步骤， 因而操作更简单。快速银染法首先将固定和染色两步 合二为一,即固定和染色反应同步进行,其次是省略了 漂洗，完成染色后，只需将染色液控干,就可直接进行 显影，因而大大简化了操作，此外，染色液和显影液均 可重复使用，进一步简化了操作，降低了成本。

弱碱法染色的背景浅，更适于观察，目前如品种指 纹图谱分析这类研究中一般需要尽可能区分出各种差 异片段，所以多用弱碱法M。而在分子标记辅助育种 中，需要大规模多态性检测，聚丙烯酰胺凝胶电泳银染的影响因素，需要高效率的检测系统，强 碱法及两种简易银染法具备了省时、高效率、低成本、操 作简便的特点,尽管强碱法染出的背景较深，但并不影 响观察结果，因此在分子标记辅助育种中非常适用M。

2结语

PAGE是一种常用的DNA检测方法，广泛应用于 AFLP、SR等分析手段。聚丙烯酰胺凝胶电泳银染的影响因素，应用的关键是PAGE银染技 术,很多实验室在应用此分析手段时常常发现银染结 果不理想，主要是染色过程中药品出现问题或染色程 序选择不合适。染色过程中很难对中间结果进行确 定，而且整个PAGE银染过程涉及的药品多而杂，不可 能对药品进行逐个实验。在染色结果不理想时，只能 更换全部药品，费时费钱，所以掌握PAGE银染技术中 各种药品使用的浓度和作用时间非常重要。银染程序 是影响银染结果的另一重要因素，实验者可根据实验 需求使用适合的实验程序，以达到最好的实验效果。