聚丙烯酰胺(PAM)是一种线型水溶性高分子 聚合物，是丙烯酰胺均聚物和共聚物统称，可溶 于水，具絮凝性、增稠性、耐剪切性、降阻性、 分散性等性能rn。被广泛应用在石油开采、水处 理、纺织、造纸、选矿、医药、农业等领域[2-3]。 但是，PAM在为油田生产提高米收率问时，对地 面工程产生恶劣影响[3]。

注人地层的PAM随原油/水混合液进人地面油 水分离与水处理终端，聚丙烯酰胺降解菌的分离鉴定及其降解特性,大幅度提高混合液粘度和 乳化性，使油水分离难度加大，造成采出水含油 量严重超标。部分含较高浓度PAM采出水外排， 使PAM进人地下油层，很难避免其渗透到地下水 层。PAM在地面水体和地下水中长期滞留，不仅 会改变水的理化性质，PAM本身会产生一部分化 学需氧量COD，也会对当地水环境造成严重污染[4]， 释放伤害人和动物周围神经系统丙烯酰胺'因 此，寻找一种高效降解PAM的方法是PAM使用者 和环境保护者的研究课题。

近年来，随着微生物技术发展，微生物修复 技术成为降解PAM使其无害化重要手段[6]。PAM生 物降解菌筛选成为本领域研究热点[7-8]。黄峰等从 中原油田取样的污水中培养出的硫酸盐还原菌， 可在聚合物驱油中生长繁殖并使PAM发生降解， 1 000 mgf的PAM溶液的粘度损失达19.6%『'夏 彦渊等从油田污水中分离出7株对聚丙烯酰胺的降 解有显著效果的细菌，在以原油为基础培养基碳 源，以NH4H2PO4为基础培养基氮源，在最佳条件下 7株混合菌对聚丙烯酰胺粘度降解率可达32.6%[|0]。 张英筠等在被聚丙烯酰胺污染的水样和土壤筛选 出生长良好菌种3株，优势菌在高浓度的PAM溶 液中最适合的生长浓度为1 000~10 000 mg-L-1，并 对10 000 mg • L-1的PAM溶液有良好降解效果，此 菌种还可以对丙烯酰胺高效降解，使降解过程不 会对环境造成二次污染[11]。包木太等从胜利油田采 出水中筛选出1株PAM降解细菌，在温度为 35丈、pH为7.5的条件下，500mg-L-1PAM溶液降 解率最高可达到38.4%，降解后不会对环境产生二 次污染[8]。

本试验从聚丙烯酰胺生产厂区土壤中分离鉴 定出1株降解聚丙烯酰胺的细菌。研究该菌株的降 解能力及其适应条件，旨为聚丙烯酰胺生物修复 提供菌株资源和科学依据。

1材料与方法

1.1材料

菌源样：大庆炼化聚合物二厂厂区土样。

基础培养液：蔗糖30g，K2HPO4.3H2O1.6g， KH2PO4-3H2〇 0.4 g，MgS〇4-7H2〇 0.06 g，NaCl 0.5 g, Fe(S〇4)3 0.03 g, CaCL 0.01 g, CuS〇4 0.05 mg, ZnS〇4 0.05 mg,蒸馈水 1 000 mL。

富集培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5 g,蒸馈水 1 000 mL。

1.2方法

1.2.1聚丙烯酰胺优势降解菌的筛选与分离

采用平板胁迫驯化法筛选出聚丙烯酰胺优势降 解菌[12]，并采用平板法分离纯化菌株，保存备用。 1.2.2聚丙烯酰胺优势降解菌的鉴定 1.2.2.1聚丙烯酰胺优势降解菌的形态及生理生化特征

本试验参照文献[13-14]中菌株的常规鉴定方 法，对聚丙烯酰胺优势降解菌进行鉴定：①观察 菌株在牛肉膏固体培养基上的培养特征；②进行 革兰氏染色；③在显微镜及扫描电镜下观察菌株 的形态特征[14];④进行葡萄糖发酵、氧化酶、过 氧化氢酶、甲基红、淀粉水解、产氨、硝酸盐还 原、产吲哚、硫化氢、明胶液化、V-P试验等生理 生化试验。

1.2.2.2聚丙烯酰胺优势降解菌16S rRNA序列测定

降解菌16S rRNA序列测定由上海生工生物工 程技术服务有限公司完成。采用16S rRNA序列测 定法对菌株DNA进行提取、扩增及序列测定。所得 测序结果通过BLAST程序与GenBank中核酸数据进 行序列搜索比对后，选择亲缘关系较近的菌株作为 参比菌株，用MEGA4.0软件构建系统发育树。

结合菌株形态分析、生理生化特征和16S rRNA序列测定及系统发育分析，初步鉴定菌株的 归属。

1.2.2.3菌悬液的制备和OD值的测定

根据参考文献[15]制备菌悬液，OD™为 1.000, 4丈下保存备用。

1.2.2.4聚丙烯酰胺浓度的测定

采用淀粉-碘化镉分光光度法测定聚丙烯酰胺 浓度[17]。

1.2.2.5优势降解菌的降解特性

采用单因素试验法，设定不同的初始聚丙烯

88

90

IOQ

酰胺浓度、pH、温度，来研究其对降解率与底物 pH的影响，以确定降解菌降解的最佳培养条件。

2结果与分析

2.1聚丙烯酰胺优势降解菌的筛选与鉴定

通过PAM为唯一氮源的平板胁迫培养法筛选 分离出1株耐受PAM能力强、降解率高的细菌， 命名为PAMB3。

2.1.1PAMB3的培养特征和形态特征

通过牛肉膏固体培养基培养3 d观察，PAMB3 单菌落为圆点状，聚丙烯酰胺降解菌的分离鉴定及其降解特性,表面凸起略有褶皱，白色，不 透明，营养琼脂上有可溶性色素(见图1)。

该菌扫描电镜放大5 000倍显示为短杆菌、产 芽孢、无鞭毛，菌体大小为（0.38~0.45)mmx (1.73~1.97) mm。

 

图1 PAMB3的扫描电镜图片(X5000) Fig. 1 SEM Image of PAMB3(x5000)

2.1.2PAMB3的生理生化特征

革兰氏染色及生理生化实验表明，降解菌 PAMB3为革兰氏阳性菌，葡萄糖产酸、吲哚试 验、硫化氢试验、VP试验、明胶液化、氧化酶试 验、淀粉水解、硝酸盐还原试验、甲基红试验均 为阳性，葡萄糖产气、过氧化氢酶试验、产氨试 验均为阴性。

2.1.3PAMB3 的 16S rRNA 序列分析

PAMB3的16S rRNA序列测定结果显示，其 DNA测序长度为1 455 bp。测序结果在通过BLAST 程序与GenBank中核酸数据进行序列搜索比对，选 择亲缘关系较近的8菌株作为参比菌株，其16 S rRNA序列与枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)相似 度达到99.9%,用MEGA4.0软件构建系统发育树 (见图2),其在Genbank上的登录号为KF051998。

PAMB3(KF051998)

Bacillus subtilis partial (HE681728.1)

Bacillus subtilis strain (JQ435698.1)

Bacillus megaterium strain (Q96576 8.1)

6^ ^1 Bacillus safensis strain (JQ951230.1)

1〇C Bacillus pumilus strain (JQ965500.1)

Bacillus cereus strain (JQ951231.1)

Bacillus licheniformis strain (JQ846014.1) Bacillus macauensis (AKKV01000016.1)

图2 PAMB3的系统发育树 Fig. 2 Phylogenetic tree of PAMB3

2.2降解菌PAMB3的降解特性

2.2.1降解菌PAMB3对PAM的降解曲线

无菌条件下，将2 %的菌悬液加人含500 mg.L-1 聚丙烯酰胺的基础培养液中，3次重复，置于空气 浴摇床(30丈，120 r.min1)进行培养，每天取样测 定培养基pH和聚丙烯酰胺的降解率变化情况，结 果见图3。

由图3可以看出，在培养的过程中培养基pH 值与聚丙烯酰胺的降解率变化规律恰好相反，培 养基pH值逐渐降低而降解率逐渐升高，这是由于 淀粉碘化镉法测定的是酰胺键的含量，降解率大 小表征其降解程度，另降解菌将聚丙烯酰胺中的 酰胺键水解成羧基，导致培养液pH下降，聚丙烯酰胺降解菌的分离鉴定及其降解特性,故pH 的变化也可表征酰胺键的降解程度，故表现出相 反规律。培养7 d后细菌生长进人稳定期，菌体的 pH值和降解率均变化不大，聚丙烯酰胺的降解率 在 34%。

2.2.2底物浓度对PAM降解的影响

无菌条件下，在含不同初始聚丙烯酰胺浓度

o o o o C

5 4 3 2 1

uo-sKPRIrpQ

(％)#*铿

的基础培养液中，接人2%(V/V)菌悬液，设3次重 复，置于空气浴摇床(30丈，120 r.min-1)培养7 d, 取样测培养基pH,计算聚丙烯酰胺降解率和降解 量，其结果见图4、5。

 

图4 PAM初始浓度对降解的影响 Fig. 4 Effect of the initial concentration of polyacrylamide on degradation

2.2.3温度对PAM降解的影响

 

图5 PAM初始浓度对PAM降解量的影响 Fig. 5 Effects of the initial concentration of polyacrylamide on degradation amount

—降解率 Degradation rate -OD

0 5 0 2 11

UOIl!?PRIrp>Q

(％)#槳铿

0 5 0 5 0 5

5 4 4 3 3 2

 

OD值

OD value

-0 5 0 5 0 -21100

45678910 11 1：

pH

图7初始pH对PAMB3降解的影响 Fig.7 Effect of pH on polyacrylamide degradation

由图4、图5可以看出，在底物浓度为50~1 500 mg.L-1变化时，聚丙烯酰胺降解菌的分离鉴定及其降解特性,聚丙烯酰胺降解率和降解量均 随初始聚丙烯酰胺浓度的增加而先升高后降低， 而pH变化恰好相反。pH值极小值及降解率极大值 出现在初始浓度300~500 mg.L-1处，而降解量最大 值出现在初始浓度500 mg.L-1处。当初始聚丙烯酰 胺浓度较低时，培养液内氮源不足，限制菌体的 生长。当初始聚丙烯酰胺浓度过高时会抑制菌体 的生长和降解。综合考虑确定500 mg.L-1聚丙烯酰 胺为较佳初始浓度。

由图6可知，从15丈开始，随温度增加PAM降 解率迅速上升，在30丈时降解率达最大值；超过 30丈时，降解率则随温度的升高而下降。而pH变 化恰好相反。PAMB3的适宜温度为25~40丈。

2.2.4pH对降解PAM的影响

无菌条件下，用1 mo卜L-1的盐酸和1 mol.L-1的 氢氧化钠调整基础培养液的初始pH值，灭菌后加 人聚丙烯酰胺，使其浓度为500 mg.L-1，再按照 2%比例接人菌悬液，3次重复，置于空气浴摇床 (30丈，120 r.min-1)进行培养，7 d取样测菌体生 长量和聚丙烯酰胺降解率。

无菌条件下，按2 %接菌量将菌悬液加人到含 聚丙烯酰胺浓度为500 mg.L-1的基础培养液中，设 3次重复，置一定温度空气浴摇床（120 r.min1) 培养7 d取样，测培养液pH和聚丙烯酰胺降解率， 结果见图6。

▲降解率 Degradation rate n 7-2 -^pH/

 

15202530354045

温度(TO

Temperature

图6培养温度对PAMB3降解的影响 Fig. 6 Effect of temperature on PAMB3 polyacrylamide degradation

6.2

由图7可以看出，在pH 6~11能保持较高的降 解能力。3.0~9.0，菌株的生长量和聚丙烯酰胺的 降解率随着pH值的升高而迅速增大；pH在9.0时 菌株的生长量和聚丙烯酰胺的降解率均达最大值， 为45.04%。9.0~12.0，菌体生长量和降解率均随 pH的升高而减小。pH矣4和pH&12时菌种基本不 生长，该菌株较适合在偏碱性条件下生活。

3讨论与结论

本试验分离降解菌PAMB3在聚丙烯酰胺初始浓 度为500 mg.L-1，聚丙烯酰胺降解菌的分离鉴定及其降解特性,温度为30丈，pH 9.0时，降解率较 高为45.04%，由于其最适pH为偏碱性，当培养基 pH 8~10时，降解率均在40 %以上，因此此菌株较 适合应用在3次采油废水处理中。由于芽孢杆菌繁 殖快速、生命力强、体积大，能有效抑制有害菌生 长繁殖，在工农业和医学上都有广泛应用。目前研 究多将芽孢杆菌作为饲料添加剂、微生物肥料及酶 制剂等。本试验分离的枯草芽孢杆菌PAMB3可应 用到处理采油废水中降解聚丙烯酰胺，无二次污 染，对聚丙烯酰胺生物修复具有重要意义。

本试验采用平板胁迫驯化方法，筛选出一株可 利用聚丙烯酰胺为唯一氮源生长的细菌PAMB3, 通过形态分析、生理生化实验及16SrRNA序列分 析，初步鉴定PAMB3为枯草芽孢杆菌(Bac瓜似 设^)。本研究表明，PAMB3对聚丙烯酰胺的降解 能力与温度、pH及底物浓度相关。PAMB3降解聚 丙烯酰胺的适宜条件初始浓度为200~700 mg.L-1， 温度为25~40丈，pH为6~11。