聚丙烯酰胺降解菌株分离及其系统发育分析:
聚丙烯酰胺降解菌株分离及其系统发育分析,应用Hungate厌氧技术，从大庆油田采油五厂十三区聚合物配注站的母液罐中分离到一株聚丙烯酰 胺降解菌株CMW,该菌株为G+,杆状，黑色圆形菌落，最适温度为38 °C,最佳jH为7. 8^具有硫酸盐还原功 能，产H2S严格厌氧.研究表明,该菌株能以聚丙烯酰胺为唯一碳源，降解侧链，部分官能团发生改变，质量 浓度为500mg/L时菌株具有较高的聚丙烯酰胺降解能力，其溶液黏度下降效果显著.通过形态、生理生化、 16S rDNA以及16S~ 23S DNA间隔区序列鉴定，可能为梭菌属的新种，暂时命名为Cfostridium. sticklondii CMWf(G«iBank登录号为DQ011249). 16SJRNA基因序列较为保守更适合属间的鉴定，16S~23S DNA间隔 区序列包含tRNAIle* tRNAAk基因，更适合属内种间鉴定.
2.2 CMW菌株对聚丙烯酰胺的降解
2. 2 1 CMW菌株对聚丙烯酰胺黏度的改变 〇 PCR反应在pTC- 200上进行扩増，20LL的近年来，国外研究者发现聚丙烯酰胺的降解
烃、胶质及沥青质）与水之间流度比下降，减弱水 的黏性指数，从而提高原油采收率[1].聚合物驱 油的采出液中，不仅含有原油，而且还含有聚丙烯 酰胺，含聚丙烯酰胺的污水是一类比较复杂、特殊 的污水，具有含油多，黏度大的特点[2-3].寻找能 产生还原性物质的微生物，促进聚丙烯酰胺的连 锁氧化降解反应，从而完成聚丙烯酰胺的降解，是 解决含聚污水外排的重要途径，聚丙烯酰胺降解菌株分离及其系统发育分析,目前有关聚丙烯 酰胺降解的微生物报道很少.
试验从大庆油田聚合物配注站的母液罐中筛 选出了降解聚丙烯酰胺的硫酸盐还原功能菌株， 进行生理生化、16S DNA序列和16S~ 23S iDNA 间隔区序列克隆测序，对其系统发育进行分析，同 时对聚丙烯酰胺降解进行初步研究.
1材料和方法
1.1菌种的来源、实验材料
菌种来源于大庆油田五厂十三区聚合物配注 站，取样点为注入工艺母液罐中的聚合物水溶液 (8000mg/L 洱=7.8~8.0).
采用Hungate厌氧操作技术、绝迹稀释法[4] (MPN)以及/滚管”培养对样本进行分离，多次纯 化获得纯菌株CMW.具体方法：向改良后Starkey 培养基（K2HPO4 0■ 5 g，NH4C 11.0 g Na2S〇4 2 g CaCl. 2H2O 0■ 1 g MgSO4 • 7H2O 2. 0 g 酵母膏 1.0 g 60%的乳酸钠溶液6 mL蒸馏水1000 mL 7 8)中加入0.2%的刃天青溶液，培养基煮 沸后，加入L-半光盐酸盐0. 5 g通入高纯氮气 驱氧 30mi，121 °C 灭菌 20min 3% 的 FeS〇4 • (NH4)2 SO4溶液单独加入，固体培养基加入 1. 6%的琼脂糖.CMW菌株于液体培养基中38 °C 培养48 h后，在光学显微镜（O ympus COVER - 018)下革兰氏染色观察，透射电镜（H2600A，H- TACHI)下观察菌体的形态和结构.按简明第八 版伯杰氏细菌鉴定手册》进行生理鉴定.
1. 2 16S IDNA和 16S~ 23S IDNA 间隔区序列 的克隆与测序
用试剂盒(宝生物公司）提取菌株DNA，采用 通用引物进行PCR扩増，16S iDNA序列的引 物[5] Eubac27F: 5' - AGAGTTTGATCCTGGCT- CAG- 3.，1492R： 5. - GGTTACCTTGTTACGACTT -3’； 16S~ 23S DNA 间隔区的引物[6] P1 5’ - GGGGTGAAGTCGTAACAAGGTA- 3’， P2 5’ - CCTCTGACTGCCAGGGCATCC- 3’；引物由大连 宝生物有限公司合成.
反应体系内含:模板40 ng左右，TagDNA聚合酶 (大连宝生物）终浓度为0■ 3 U，dNTP为 0. 3mmo1/L引物各0. 1 Lmol/I;扩増程序为： 94 °C预热 5 m n 94 °C变性 30 s 58 °C复性 45 s 72 °C延伸90 s循环30次，最后72 °C延伸 10m in扩増产物与1. 0%的琼脂糖电泳检测.用 胶回收试剂盒(宝泰克）切胶回收，后与pGEM - T (Piomega)载体连接，转化到大肠杆菌TOP10感 受态细胞（天为时代）.LB固体培养基中加入氨 苄青霉素Amp(5Lg/mL)和X- gal蓝白斑筛选 转化子.提取质粒（华舜），用载体引物T7和SP6 检测.测序由上海生物工程有限公司完成.
将测得的 16S iDNA、16S~ 23S iDNA 间隔 区序列在GenBank进行Blast对获得的同源序 列进行序列分析.用BbEditv5.06进行多序 列比对，采用MEGA3.1软件中的邻接法构建 进化树.
1.3分析方法
硫化氢气样采用Sp- 2000型气相色谱仪进 行分析，FPD检测器，聚丙烯酰胺降解菌株分离及其系统发育分析,柱温60 °C，以25% B，B -氧 二丙晴为固定相；液相末端产物分析：中国产 GC112型气相色谱仪，氢火焰离子检测气，测定条 件（担体 GDX- 103(60- 80 目）+ 2%H3P〇4,填 充柱长2 m x <5 mm，载气N;进样量2 LL);聚 合物浓度:淀粉-碘化镉法;聚合物黏度测定，采 用H akke Bush黏度仪，恒温水浴45 °C，转子转速 6 r/min;聚丙烯酰胺干粉、水作用后的聚丙烯酰 胺以及微生物降解产物干粉，经KBr压片，采用 红外光谱法（Spectrum One FFR，PE)进行分析.
2结果与分析
2.1形态和生理生化鉴定
CMW菌株为杆菌，长度在0.4~ 0. 6 Lm x 0. 6Lm~ 3. 0Lm，G+，无芽孢，能运动，有4根鞭
毛（图1).在含有亚铁盐的乳酸盐-硫酸盐固体 培养基中形成黑色圆形菌落，表面凸起、光滑，边 缘整齐.利用硫酸盐、亚硫酸盐和还原性硫化物起 电子受体作用，并还原成H2S保留时间为0. 323 (图2)，严格厌氧.碳源为乳酸钠、苹果酸、葡萄 糖、琥珀酸、酵母膏和蛋白胨的培养基中生长.不 同碳源作为底物中生长状况各异，在酵母膏中生 长最好.能以硫酸氨、尿素为氮源.液相末端产物 为乙酸、丙酸、丁酸、乙醇.
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产物可作为细菌生命活动的营养物质，细菌对降 解产物的消耗促进聚丙烯酰胺的降解.选用抗盐 聚丙烯酰胺（KYPMA1600)，代替乳酸钠作为碳 源，用蒸馏水配制成不同质量浓度聚丙烯酰胺 (50 mg/L、 100 mg/L、 150 mg/L、 200 mg/L、 400mg/L、 600 mg/L、 800 mg/L、 1000 mg/L、 1200mg/L)培养基，灭菌后加入3%»维生素C；作 为还原剂消耗经过高压灭菌产生的自由基|71，接 种量为10%.接种后54 h记数的结果表明，聚丙 烯酰胺质量浓度在400~ 800mg/L时细菌数量较 大，最适宜的质量浓度为600 mg/L由图3可见， 质量浓度为600mg/L时CMW菌株生长曲线和 聚丙浓度变化，在培养后的36 h进入对数生长 期，72 h后进入稳定期.特别是进入对数生长期 聚丙浓度降低较快.同时选择4个点测定了聚丙 烯酰胺溶液黏度，黏度变化较大，由接种时的 18. 5mPa•到第 48 h的 8. 6mPa. s 至第 168 h 的3.4mPa. s第480h的1.1mPa. s该菌株对 于降低黏度效果显著.
生长曲线
CMW菌株的透射电镜照片(
50000)
0.260.280.30 0.320.34 0.360.38
t/min
图2 H2S气体在气相色谱中的保留时间
•聚合物浓度
培养时间/d
图3 600mg/L时CMW菌株的生长曲线和聚丙浓度变化
2.2 2 CMW菌株对聚丙烯酰胺结构的改变
聚丙烯酰胺降解产物中，低相对分子质量化 合物除含双键、环氧和羰基的聚丙烯酰胺碎片外， 聚丙烯酰胺降解菌株分离及其系统发育分析,大多属于一般丙烯酰胺低聚体的衍生物.由图4 可见,水作用后的吸收峰与干粉样品相比出现新 的峰值，1567. 32峰代表羰基，3433. 22峰代表N -C键断裂;菌株作用后,相对于样品和水溶液， 在620. 36到1298. 76峰值是各种不同的苯环结 构，多为菌株降解的产物.表明CMW菌株以聚丙 烯酰胺为碳源和氮源，降解侧链，部分官能团发生 改变，导致聚丙烯酰胺断链和溶液黏度下降.
2. 3 16S lDNA 序列和 16S~ 23S lDNA 间隔区 序列系统发育学分析
经测序后获得1536bp的16S iDNA序列， GenBank登录号为DQ011249,序歹J在GenBank中
进行比对，挑选同源序列分值较高的有代表性菌 株，以Therm o togasp. ( A J872271 )、
Desuforh〇pa1us vacuo latus ( DSRRG )为参比菌 株，采用NJ法构建系统进化树.
由图5可见，系统发育树中参比菌株与其他 参试菌株明显地分开，14个菌株的平均遗传距离 为0. 1790(方差为0.0079). 16S iDNA序列比对 的结果表明，CMW 菌株与 Clos/ridium. stick land ii (CLORRSA)的相似性水平达98%，该菌株分离 自生产氨的废水中，而CMW菌株分离自纯聚合 物的母液罐中，能以聚丙烯酰胺为唯一碳源，不发 生毒害作用，并且具有硫酸盐还原功能，结合菌株 的形态和生理生化特性，初步鉴定可能为梭菌属 的新种，暂时命名为Clos/ridium. stick land ii CMW.获得16S~23S DNA间隔区序列长度为 346bp 只有 Thermo toga .sp.( AJ872271 )，
Methylobacterium ex/orquens (AF293375)同时具 有16S DNA和间隔区序列，相似性分别为70%， 79%，与 P. iwicus (PI16SRRNA)相似性为 98%.研究表明，16SiRNA基因序列更为保守些，
rRNA之间的基因间隔区因为没有特定功能，进 化速率比16S iRNA大10多倍[8]，更加适合属内 种水平上的鉴定.革兰氏阳性细菌多编码RNAAk 或RNA'革兰氏阴性细菌根据间隔区的片段长 短不等编码 RNA(;i1， RNALys 和 tRNAVa， RNAAk、tRNAu和tRNA(;k，还有部分间隔区根本
不含tRNA基因[9-11].本菌株排列方式16S iRNA -RNAIfc- RNAAk- 23S RNA，含有两个 tRNA 基因，即 tRNA11'和 tRNAAk.与 Themotoga (AJ872271 )，M ethylobacteriumex torquens
(AF293375)具有相同的基因结构.
图5基于CMW菌株和相近的菌株16S rDNA序列构建的NJ系统发育树
3结论
1)应用Hungate厌氧技术分离到的CMW菌 株，为杆菌，长度在0■ 4~ 0-6 Lm @ 0. 6 Lm ~
3.0 Lm，G+，无芽孢，能运动，有4根鞭毛，具有硫 酸盐还原功能，产H2^严格厌氧.
2)(MW菌株能以聚丙烯酰胺为唯一碳源，降解
侧链，其部分官能团发生改变，聚丙烯酰胺溶液黏度 下降效果显著，聚丙烯酰胺降解菌株分离及其系统发育分析,具有较高的聚丙烯酰胺降解能力.
3 ) CMW 菌株与 Cbstridium. stickkindii (CLORRSA)的相似性水平达98%，结合菌株的 形态和生理生化特性，初步鉴定可能为梭菌属的 新种，暂时命名为 Clostridium sticklandii CMW.
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