聚丙烯酰胺水凝胶中丙烯酰胺单体的提取及高效液相色谱测定:

聚丙烯酰胺水凝胶中丙烯酰胺单体的提取及高效液相色谱测定,聚丙烯酰胺水凝胶（Polyacrylamide Gel，PAMG)自1997年由乌克兰及俄罗斯引入我国后，在整形外科广泛应用于注射隆乳术，后因出现硬结、移 位、疼痛、炎症等多种并发症，国家食品药品监督管理局于2006年4月全面 禁止聚丙烯酰胺水凝胶在整形外科的应用。据估计，到目前为止我国有超过 30万人接受了聚丙烯酰胺水凝胶注射隆乳，而产生众多并发症的原因仍不确定。

医用聚丙烯酰胺水凝胶是由丙烯酰胺（acrylamide，AM)单体与N,N’- 亚甲基双丙烯酰胺（N,N’-methylenebisacrylamide，BIS)作为交联剂共聚后

与大量水溶胀而成的水凝胶状物，本身没有毒性，但其聚合原料丙烯酰胺对 人体有神经毒性及可能的生殖毒性、致癌性。聚丙烯酰胺水凝胶在农业中作 为高吸水性材料可用作土壤保湿剂，有研究表明土壤中的聚丙烯酰胺水凝胶 可以发生一定的降解，而生物组织中复杂的环境与土壤有一定的类似性，因 此考虑其在人体中有可能发生降解。因为聚丙烯酰胺水凝胶本身的结构特性 致使对其的化学检测方法有限，对其含有的化学成分的提取成为关键。以往 对其的检测方法缺乏科学性。近年来在食品行业中，食品中的丙烯酰胺含量 受到关注，已经建立了多种成熟的丙烯酰胺检测方法。国内虽已有报道从并 发症患者体内取出的聚丙烯酰胺水凝胶中检测到丙烯酰胺单体，然而未给出 具体的检测方法[1]。

本课题将对聚丙烯酰胺水凝胶中丙烯酰胺单体的提取及检测方法进行研

究。

以下对本课题相关研究进展进行文献回顾。

1聚丙烯酰胺的化学特性及应用 1.1聚丙烯酰胺及丙烯酰胺的化学特性

聚丙烯酰胺由丙烯酰胺单体在引发剂作用下均聚或共聚而成，形成一系 列产品，主要有非离子型、阴离子型、阳离子型、交联型。非离子型由丙烯 酰胺均聚而成，阴离子型由丙烯酰胺均聚后水解而成或由丙烯酰胺和丙烯酸 共聚而成，阳离子型由丙烯酰胺与乙烯基阳离子单体共聚而成，交联型由丙 烯酰胺和N,N’-亚甲基双丙烯酰胺作为交联剂共聚而成[2]。

丙烯酰胺是一种白色无味的晶状固体，熔点84.5°C[3]，可溶于多种极性 溶剂，包括丙酮、乙腈、水等。30°C，lOOmL水可以溶解215.5g丙烯酰胺。 丙烯酰胺有两个重要的功能基团，C = C烯键和氨基。C = C烯键因为缺电子 而使丙烯酰胺易于发生多种化学反应，包括亲核加层反应、Diels-Alder反应、 自由基反应[4]。因此，氨、脂肪胺、磷化氢、氯、溴、亚硫酸盐均可与C = C 烯键发生反应。氨基的反应包括水解、脱水、醇解、醛浓缩[5]。

丙烯酰胺是一种急性的眼、皮肤、呼吸道刺激物，可以通过多种途径被 人体吸收，包括静脉、腹膜、皮下、肌内、口腔、皮肤等。丙烯酰胺的毒性 已经过充分的研究，记载于多篇文献中[6_8]。

高等动物一旦吸收丙烯酰胺，将导致中枢神经系统的损伤，产生上行性 中央或周围神经病。这种神经病波及神经的长度和程度取决于中毒的水平， 通常以周围和脊髓的上行束的感觉、运动、自主神经的功能破坏为标志。丙 烯酰胺已被美国环保局（U. S. Envirnment Protection Agency, EPA)归类为B2 类疑似致癌物，即有充足的动物致癌证据但缺乏足够的人类致癌证据[9]。

丙烯酰胺可被有机体代谢为多种化合物并排泄。Dearfield等[1()]最近的研 究表明丙烯酰胺的一些代谢产物表现出诱发基因突变的特性。例如，丙烯酰 胺双键氧化形成一种相对稳定的环氧衍生物一环氧丙酰胺（Glycidamide)。 环氧丙酰胺可诱发沙门氏菌的基因突变，并认为可能对其他测定系统有广泛 的基因突变作用[1()]。因此，在评价丙烯酰胺毒性的时候，评价丙烯酰胺的代 谢及降解产物的毒性也很必要。

虽然有大量关于丙烯酰胺对动物的毒性文献，但是由于缺乏人类的研究 数据而难以确定丙烯酰胺的安全暴露浓度。在丙烯酰胺毒性的研究中习惯用 ppm (10_6)来表示丙烯酰胺的浓度。动物实验结果为丙烯酰胺无可见作用剂 量（NOEL)为0.2〜2ppm，最低可见作用剂量（LOEL)为1〜3ppm。需要建 立一种假设来把动物实验的数据转换为适于人类的剂量。一般公认的人类可 接受剂量为动物水平的1/1000。因此，美国环保局规定丙烯酰胺的安全暴露 剂量为 〇.3ppb (1〇-9) [7]。

丙烯酰胺的聚合方式使得聚丙烯酰胺与丙烯酰胺的化学及生物特性完全 不同。丙烯酰胺由于有缺电子的c=c双键，成为一种活泼的化合物，而丙烯 酰胺的聚合使双键变为单键，因此在通常情况下，聚丙烯酰胺的化学特性相 对不活泼[4]。由于聚丙烯酰胺只有C一C单键而无法像丙烯酰胺一样发生亲 核加层反应。聚丙烯酰胺的氨基仍可以进行水解、脱水反应。

由于聚丙烯酰胺的某些应用与人或动物有直接接触，因此聚丙烯酰胺是 否有毒性受到人们的关注。聚丙烯酰胺的毒性问题自从20世纪50年代就被 广泛研究，如厘^：〇11紐红等[11]研究聚丙烯酰胺的摄取毒性。他们通过给大鼠 和狗服用聚丙烯酰胺进行了急、慢性毒性实验，大体及病理检查均未发现毒 性表现。在高达6000ppm的剂量下对鱼进行的毒性实验同样未发现明显的毒 性。McCollister早期的实验结果被很多学者证实[5〜1]。如Seybold[12]得出结 论：聚丙烯酰胺对人类、哺乳动物、鱼类、植物均无毒性作用。

1.2聚丙烯酰胺的应用

聚丙烯酰胺（PAM)是丙烯酰胺单体在引发剂作用下均聚或共聚所得聚

合物的统称，是水溶性高分子材料中应用最广泛的品种之一，在石油开采、 水处理、纺织印染、造纸、选矿、洗煤、医药、制糖、养殖、建材、农业等 行业具有广泛的应用，有“百业助剂”、“万能产品”之称[13]。

1997年报道世界年总需求量为65万吨，年需求增长率为10%[14]。早在 1893年，德国科学家Moureu首先合成聚丙烯酰胺，1952年美国道化学公司 获得了聚丙烯酰胺的专利权，并于1954年开始工业化生产。我国于1966年 在兰州白银有色金属公司建立了国内第一条聚丙烯酰胺生产线。2005年，我 国市场需要聚丙烯酰胺共14.2万吨[15_17]。

1.2.1水处理领域

聚丙烯酰胺在水处理工业中的应用主要包括原水处理、污水处理和工业 水处理3个方面。在原水处理中，聚丙烯酰胺与活性炭等配合使用，可用于 生活水中悬浮颗粒的凝聚和澄清；在污水处理中，聚丙烯酰胺可用于污泥脱 水；在工业水处理中，聚丙烯酰胺主要用作配方药剂。在原水处理中，用有 机絮凝剂聚丙烯酰胺代替无机絮凝剂，即使不改造沉降池，净水能力也可提 高20%以上。所以目前许多大中城市在供水紧张或水质较差时，都采用聚丙 烯酰胺作为补充。在污水处理中，采用聚丙烯酰胺可以增加水回用循环的使 用率間。

1.2.2石油采油领域

在石油开采中，聚丙烯酰胺主要用于钻井泥浆材料以及提高采油率等方 面，广泛应用于钻井、完井、固井、压裂、强化采油等油田开采作业中，具 有增粘、降滤失、流变调节、胶凝、分流、剖面调整等功能。目前我国油田 开采已经步入中后期，为提高原油采收率，目前主要推广聚合物驱油和三元 复合驱油技术。通过注入聚丙烯酰胺水溶液，改善油水流速比，使采出物中 原油含量提高。目前国外聚丙烯酰胺在油田方面的应用不多，我国由于特殊

的地质条件，大庆油田和胜利油田已经开始广泛采用聚合物驱油技术[19]。 1.2.3造纸领域

聚丙烯酰胺在造纸领域中广泛用作驻留剂、助滤剂、均度剂等。它的作 用是能够提_纸张的质量，提_楽■料脱水性能，提_细小纤维及填料的留着 率，减少原材料的消耗以及对环境的污染等。聚丙烯酰胺在造纸中使用的效 果取决于其平均分子量、离子性质、离子强度及其它共聚物的活性。非离子 型聚丙烯酰胺主要用于提高纸浆的滤性，增加干纸强度，提高纤维及填料的 留着率；阴离子型共聚物主要用作纸张的干湿增强剂和驻留剂；阳离子型共 聚物主要用于造纸废水处理和助滤作用，另外对于提高填料的留着率也有较 好的效果。此外，聚丙烯酰胺还应用于造纸纤维回收[2()]。

1.2.4纺织印染工业

在纺织工业中，聚丙烯酰胺作为织物后处理的上浆剂、整理剂，可以生 成柔顺、防皱、耐霉菌的保护层。利用它的吸湿性强的特点，能减少纺细纱 时的断线率；聚丙烯酰胺作后处理剂可以防止织物的静电和阻燃；用作印染 助剂时，聚丙烯酰胺可使产品附着牢度大、鲜艳度高，还可以作为漂白的非 硅高分子稳定剂；此外，聚丙烯酰胺还可以用于纺织印染污水的高效净化[21]。 1.2.5其他领域

在采矿、洗煤领域，采用聚丙烯酰胺作絮凝剂可促进采矿、洗煤回收水 中固体物的沉降，使水澄清，同时可回收有用的固体颗粒，避免对环境造成 污染；在制糖工业中，聚丙烯酰胺可加速蔗汁中细粒子的下沉，促进过滤和 提高滤液的清澈度；在养殖工业中，聚丙烯酰胺可改善水质，增加水的透光 性能，从而改善水的光合作用；在医药工业中，聚丙烯酰胺可用作分离抗菌 素的絮凝剂、用作药片的赋型粘接剂以及工艺水澄清剂等；在建材工业中， 聚丙烯酰胺可用作涂料增稠分散剂、锯石板材冷却剂以及陶瓷粘接剂等；在 农业上，聚丙烯酰胺作为高吸水性材料可用作土壤保湿剂以及种子培养剂等。 在建筑工业中，聚丙烯酰胺可以增强石膏水泥的硬度，加速石棉水泥的脱水 速度。此外，聚丙烯酰胺还可用作天然或合成皮革的保护涂层以及无机肥料 的造粒助剂等[13_14a6_17]。

2聚丙烯酰胺水凝胶在整形外科中的应用及出现的并发症

医用聚丙烯酰胺水凝胶是交联型聚丙烯酰胺与大量水溶胀而成的水凝胶 状物。其结构、性质类似于实验室中电泳用的聚丙烯酰胺凝胶，后又经过多 种杂质的去除工艺，使丙烯酰胺单体含量降到0.5)ig/g以下[22]。

聚丙烯酰胺水凝胶在整形外科中的应用始于1967年，聚丙烯酰胺水凝胶中丙烯酰胺单体的提取及高效液相色谱测定,前苏联基辅的医生 用少量的线性聚丙烯酰胺进行歌唱家声带的矫正；1971年在线性聚丙烯酰胺 的基础上又研制出软接触晶体，广泛应用于近视眼的矫正，一直延用至今； 1983年开始用于治疗阳萎的阴茎局部注射，并正式把聚丙烯酰胺胶状聚合物 命名为“英捷尔法勒”，在1987年以后，“英捷尔法勒”被广泛、大量地应用 于面部、乳房、四肢及男女性器官的填充修复[23]。1997年12月，聚丙烯酰 胺水凝胶（英捷尔法勒）正式引入我国，应用于整形外科[24]。1999年，医用 聚丙烯酰胺实现了国产化（商品名为奥美定），并大量投入市场，根据厂家提 供的销售资料不完全统计，至今我国已有超过30万的妇女接受了该类材料的 注射（也有人估计超过50万）。因为操作简单、痛苦小，该方法备受患者和 许多美容院的欢迎。但随着时间的推移，临床上出现了一些并发症，主要有: 感染、血肿、硬结、增生、无菌性炎症、胸大肌炎、持续疼痛、注射物移位、 破溃及渗漏等。生产厂家和部分学者认为并发症是从业人员操作不规范所造 成的，但也有学者认为有一些问题单纯用操作失误无法解释，如所谓无菌性 炎症的发生原因并不十分明了，某些患者出现乳房反复破溃（有的患者超过 10次），而细菌培养为阴性，难以用普通并发症解释，也有患者出现持续难 忍的疼痛，但原因不明。由于各种原因而取出的充填物的物理性状发生了改 变，植入时为无色、透明、均匀一致和弹性很好的凝胶状物质，而从人体抽 出时颜色呈淡黄色、颗粒状、失去了粘弹性，而合并感染者抽出的充填物外 观如食糜样。由于上述原因，自从该材料引入我国之后，其安全性一直倍受 学术界的关注和质疑，更有部分学者强烈反对其应用[25_27]。后因社会反响强 烈，国家食品药品监督管理局于2006年4月全面禁止聚丙烯酰胺水凝胶的在 整形外科的应用。

3液相色谱分析样品前处理技术

样品前处理包括样品的采集、萃取、净化和浓缩。萃取与净化是其主要 环节。而萃取与净化方法常常交织在一起。

萃取的目的是将目标物从样品中转移至溶液。根据样品的成分、水分和 脂肪含量、目标物的理化性质和在样品中的存在形式，选择不同萃取溶剂和 萃取方法。萃取原则是从样品中尽可能完全地萃取出目标物，尽量少萃取出 干扰测定的共萃取物。常用萃取方法如下。

3.1索式萃取

索式萃取法（Soxhlet Extraction)系样品通过连续循环回流萃取，萃取回 收率高，是一种经典的萃取方法。在建立新方法时，常用这种萃取方法作为 对照方法。适用于低挥发性、热稳定性分析物的萃取。它的优点是：（1)新 溶剂不断与样品接触从而使分析物溶于溶剂而萃取出；（2)维持相对较高的 萃取温度；（3)不需要进一步离心或过滤；（4)操作简单经济。缺点：（1) 萃取时间较长；（2)需要消耗大量溶剂、冷却水；（3)不能在萃取过程中搅 拌以加速萃取；（4)因为用了大量的溶剂，而需要进一步浓缩处理；（5)由 于长时间处于萃取剂的沸点温度，分析物可能会分解[28]。近几年出现在市场 上的自动索式萃取器克服了传统索式萃取的部分缺点，萃取时间明显缩短，

结果的可重复性与传统法相当[29]。目前这种新方法已被广泛应用于植物、食 品中脂类、多环芳香类化合物的检测[29_3()]。

3.2超声波萃取

样品加溶剂进行超声波萃取是一种有效的萃取方法。超声波搅拌使固- 液接触更密切，而产生的和缓的加热有助于萃取过程的进行。将细颗粒状样 品置于瓶中，加入溶剂，将瓶浸于超声波浴中受到超声波辐射，以超声波加 速分析物的溶解和扩散，提高萃取效率。

超声波的频率在16kHz〜1GHz，人无法听到。超声波振动是分析物从样 品中释放出来的能量来源。萃取效率的提高源于声压的作用[31]。在超声萃取 中，最重要的现象是：空化作用（大部分空泡的形成与崩解)，接触面的摩擦 和扩散率的提高。空化作用最为关键，因为它对液体中发生的很多现象都有 直接的影响。空化作用包括强伸展力而致的小泡形成，来源于局部突然的压 力差[31]。在持续的超声强度下，小泡的形成与崩解形成动力学平衡。小泡的 形成与崩解过程活跃的作用于固液接触面，从而提高的固体侵蚀过程[31]。

超声萃取持续时间一般由几分钟到30分钟不等，也有长达60-70分钟的 [32_34]。回收率与相同温度下索式萃取法所得回收率相当。需要考虑的萃取条 件有超声时间，萃取剂的极性和需要量，以及样品的质量和种类。Melecchi 等[35]的研究表明萃取剂的极性和超声时间对回收率的影响较大。超声萃取的 优点是可以同时在超声池中处理多个样品。由于其在常温下进行而适合热不 稳定分析物的萃取。但是需要进一步去除杂质是本法的一个缺点。

3.3微波辅助萃取

微波辅助萃取（microwave-assisted extraction, MAE)始于 20 世纪 80 年

代，利用微波能量，快速有选择地萃取，克服了传统萃取方法的不足[3637]。 在密闭的容器中微波萃取，加热萃取溶剂使其迅速达到2倍或3倍常压时的

沸点温度，从而缩短萃取时间，使溶剂消耗大为减少。搅拌促进与溶剂的作 用，有助于从基质中释放目标物。极性分子如水、甲醇、乙醇、丙酮等可迅 速吸收微波能量来加热；非极性物质不能吸收微波能量，所以MAE中不能 使用非极性溶剂做萃取剂。然而，MAE必须克服一些内在的缺点才可拓宽它 的应用范围。化合物吸收微波能量的多少与其介电常数成比例，介电常数值 越高，能量吸收量越高。因为有机萃取典型地使用了具有很小介电常数的非 极性溶剂，因此常常必须用极性共溶剂以助溶液加热[38]。用极性共溶剂除了 目标物外，还可萃取更广谱的化合物，可引起分析中潜在的干扰。再者，微 波溶剂萃取并不排除传统的过滤和蒸发步骤。

3.4超临界流体萃取

20世纪80年代后期，随着超临界流体色谱的出现，超临界流体萃取 (supercritical fluid extraction, SFE)应用于样品制备。物质处于其临界温度

和临界压力以上的状态时，既非气体，也非液体，而是以超临界流体状态存 在。超临界流体具有似气体的高扩散性，能穿透固体物质；具有液体的溶解 特性，似液体的密度使其能将固体基质中的分析物溶解；它几乎没有表面张 力，低黏度使之便于流动。这些特性使超临界流体具有极好的萃取效力和速 度。由于超临界流体的密度既是温度的函数，又是压力的函数，因而，不论 改变温度或压力，都可使超临界流体的密度发生变化。溶质的溶解度和超临 界流体的密度有关，因而通过改变萃取压力和萃取温度就很容易改变超临界 流体密度，从而实现对特定分析物的萃取。又由于超临界流体的高蒸气压， 可以很容易从萃取物中除去，得到高度浓缩的萃取物[39]。

3.5加速溶剂萃取

1995 年首次发表了加速溶剂萃取（accelerated solvent extraction, ASE)

技术，许多实验室已用于常规样品制备。ASE是一种在较高的温度(50〜200°C)

和10〜15MPa的压力下进行的固-液萃取过程。因此，ASE是一种类似于SFE 的加压溶剂萃取。高压使得溶剂在较高温度下仍可以保持液态。在ASE过程 中，溶剂仍然低于临界状态。温度的增加在萃取动力学上提高了萃取效率， 压力的增加使溶剂保持在液态，因此可进行安全、快速的萃取。另外，高压 使得萃取池快速被填充并且利于溶剂进入固体基质。升高的温度提高了溶剂 的扩散率，从而导致萃取动力学上的萃取效率的提高[4()_42]。

在ASE萃取时，样品置于不锈钢萃取池中。加入溶剂后，萃取池加压， 加热到需要的温度，样品被静置萃取指定的时间。然后，萃取液从萃取池中 排出，再加入新鲜溶剂。根据需要重复进行这个过程数次。当萃取完成后， 压缩氮气使得萃取池中的所有液体转移到收集瓶中待检。整个萃取时间为 5〜15min，需要萃取剂的量为萃取池容量的150%左右。由于萃取液在进入收 集器前经过过滤，所以省去了后续单独的过滤步骤。

尽管用于ASE的溶剂通常是有机溶剂，加压的热水或亚临界状态的水也 用于ASE，通常被称为加压热水萃取或亚临界水萃取[43]。

非毒性萃取剂，如水、二氧化碳的使用有经济环保的优点。超临界二氧 化碳萃取被报道为一种有价值的新萃取技术，可用于营养物质的萃取。但是， 需要加入大量的极化修饰因子到二氧化碳中来萃取极性物质。ASE被认为是 一种潜在的可替换SFE的极性化合物萃取技术[4()]。与传统的索式萃取相比， 大量减少了萃取液量和萃取时间[42]。但是，值得注意的是ASE的高温可能导 致热不稳定化合物的降解。

3.6固相萃取

固相萃取（solid phase extraction, SPE)基于液相色谱的原理分离样品组

分，即样品通过固体吸附剂进行净化，固体吸着剂捕获样品中的目标物，同 时将其富集。它是20世纪80年代后期发展起来的样品前处理技术。自制的

做法是将吸着剂填入玻璃小柱或小注射器或滴管中，聚丙烯酰胺水凝胶中丙烯酰胺单体的提取及高效液相色谱测定,溶剂自然流出。商品化 以来，迅速发展成为痕量分析中样品处理的常规手段。商品化的填充吸着剂 的小柱称为柱体（cartridge)，其后又发展了萃取碟片（disk)。现今市场上出 售的多种SPE的极性、非极性或离子交换吸着剂，原来分别是为液相色谱设 计的正相、反相和离子交换等固定相。常用固相萃取剂有以下几类。吸附型: 硅胶、氧化铝、硅镁吸附剂、活性炭等；键合型：键合硅胶固相萃取剂种类 颇多，所键合的基团包括C8、C18等非极性基团，或弱极性基团如一NH2、 一CN、一OH等，及一COOH、一S03H等离子基团；非极性和离子交换网络 树脂和商聚物等。

固相微萃取（solid phase microextraction, SPME)是用一根外涂有吸着

剂的熔融石英纤维或内涂以吸着材料的小管进行萃取。由Arthur和 PawliSZyn[44]针对存在的问题，基于聚二甲基硅氧烷吸着而发展了微萃取 方法，命名为固相微萃取。由于其技术简易和性能优异，弓丨起了人们对吸着 萃取技术的极大关注。SPE与SPME的主要区别是：SPE需要在液相中萃取 目标物；而SPME用一根外涂有吸着剂的熔融石英纤维或内涂以吸着材料的 小管进行萃取。SPME可在气相和液相中萃取，而SPE只限于液相样品的萃 取。食品分析已应用SPME技术[45’46]。

3.7膜萃取

膜萃取（membrane extraction)是一类应用于许多萃取问题的技术。这些 技术只需要很少的溶剂但能得到显著的净化效力。Audunsson首先将膜萃取 作为分析化学中样品制备的工具[47]。液膜支撑萃取（supported liquid membrane extraction)是分析样品最常用的膜萃取技术。在此三相萃取技术中， 从含水试样中萃取目标物通过有机液体再进入水相。有机相保持在多孔、疏 水支撑膜间。由于毛细现象使孔中保持着有机液体。因此，存在两个不同的

平衡使此体系在化学上相似于经典的液-液萃取中的萃取和反萃取。

3.8食品中丙烯酰胺的萃取方法

丙烯酰胺性质不稳定，紫外线照射或加热至熔点时易发生聚合反应。有 文献报道[48]，在实验室条件下，0.1%的丙烯酰胺水溶液用玻璃器皿盛装，在 室温下4周就只剩原来的50%。在环境和土壤里丙烯酰胺还存在生物转化， 其半减期仅几天（20°C)。但是其在低温、避光时可以长期保存。所分析的样 品应该均匀，固体样品要碾碎，颗粒越细，提取效率越高；可采用人工和机 械磨碎两种方式，需要注意的是要充分混匀。

食品样品基质比其他性质样品（如水、土、气等）复杂得多，因而食品 样品前处理方法尤其具有特殊性。在食品品质、成分和污染物的检测中，有 机污染物分析存在更多难题[49]。（1)根据目标物的毒性、致突变性、致癌性 的强弱，它们在食品中的允许限量为mg/kg、pg/kg、ng/kg或更低，因而要 求高灵敏度的测定方法，即在lkg样品中要求能检出l(T3g、l(T6g、10、或 更低含量的目标物。（2)食品样品基质与目标物含量相差百万倍、千万倍甚 至亿倍，在此情况下，由样品中萃取目标物，应尽量减少共萃取物，选择适 宜的溶剂是十分重要的。（3)在样品萃取液中有干扰分析的共萃取物存在， 增加了分析的复杂性。样品中目标物含量极微，同时共存的大量干扰物必须 除去。

丙烯酰胺是极性小分子物质，一般采用水或极性强的有机溶剂萃取。目 前报道的食品中丙烯酰胺的萃取方法大多采用常温下的水作为萃取剂[5()_52]。 水萃取有冷水萃取和热水萃取两种方法。冷萃取是指在样品磨碎后按一定比 例加入水，振荡或搅拌30min;热萃取是在研磨的样品中直接加入60〜70°C 的热水，70°C振荡30min。丙烯酰胺在酸性溶液中稳定，碱性条件下不稳定。 有人用酸性水溶液作为萃取剂，如美国FDA建议的方法就用含0.1%的甲酸

水溶液萃取样品[53]。也有研究者为方便旋转蒸发浓缩而采用甲醇作为萃取剂 [54-55]。Young等[56]为了阻止在样品前处理过程中发生乳化作用而采用高浓度 的氯化钠水溶液来萃取样品，结果表明可以提高丙烯酰胺的回收率。也有实 验室用水-丙酮混合物作为萃取剂[571另外，日本国立医药品食品卫生研究所 的一个研究小组也采用这种混合物作为萃取剂[58]。液体样品可直接进行衍生 或净化处理后衍生，而固体样品则需要萃取后再进行净化处理和衍生。对于 脂肪含量高的样品，采用有机体系，可以萃取更完全，而且易于浓缩，便于 以后的净化处理。Biedermaim等[59]分别采用正丙醇-水（4: 1)混合溶剂和 丁酮萃取。相对于水萃取法，该体系具有以下两个优点：（1)同时萃取出包 埋在脂肪颗粒中的丙烯酰胺，提取更完全；（2)采用正丙醇-水体系时，正丙 醇和水形成共沸物，易于浓缩并去除水分；用丁酮萃取时，可用无水硫酸钠 脱水，旋转蒸发浓缩。

除了上述方法以外，ASE和索式萃取也已应用于丙烯酰胺的测定[6Q_62]。 Pedersen等[6()]采用甲醇进行索式萃取，据报道其萃取效率远高于其他方法， 但长达10天的萃取时间不能排除萃取过程中有新的丙烯酰胺形成。

样品的净化主要采用固相萃取，大多为几种固相萃取柱的连用。一种是 米用 Oasis HLB (Waters，Milford, MA，USA)和 Bond Elut-Accucat 柱 (mixedmode: Cs，SAX and SCX) (Varian，Palo Alto，CA，USA)。Becalski 等[52]用三种不同柱子连用：Oasis MAX ( mixed-mode anion exchange ) (Waters)、Oasis MCX ( mixed-mode canion exchange)和 ENVI-Carb (graphitized carbon)。另一种类似的组合是 Bond Elut C18, Bond Elut Jr-PSA (anion exchange)和 Bond Elut Accucat(all Variant58]。另一组实验室用 Isolute M-M 300mg 柱子（mixed-mode: Ci8，SAX and SCX) (International Sorbent Technology, Hengoed，UK)加上过滤或超速离心来避免阻塞色谱系统。

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Oasis HLB柱子在丙烯酰胺分析的净化步骤中应用最广泛，因为对 所有化合物和一般的SPE要求有亲水亲脂平衡和可湿的反相吸收剂。很多研 究者[63_65]报道了丙烯酰胺色谱分析前这种柱子的应用。Oasis MCX柱子也在 SPE净化步骤中应用，是一种混合模式的阳离子反相吸收剂，对基本化合物 有高度选择性。在丙烯酰胺分析中合理有效的应用可获得高精确性和高方法 回收率。Young等[56]把检测丙烯酰胺的SPE方案分为两步。第一步，用Oasis HLB柱子接真空复式接头连接真空装置使流速为2~4mL/min。第二步不用真 空因为用大颗粒的Oasis MCX柱子。在这种SPE净化条件下，日内研究得到 很好的精确度和方法精确度，通过3天得到98%的回收率和相对标准差为 9.5% (n=15)〇

4高效液相色谱对丙烯酰胺的检测 4.1高效液相色谱原理

色谱法的分离原理是：溶于流动相（mobile phase)中的各组分经过固定 相时，由于与固定相（stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸弓丨、 排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固 定相中流出。又称为色层法、层析法。

色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett)在1906年研究用碳酸钙 分离植物色素时发现的，色谱法（Chromatography)因之得名。后来在此基 础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。

液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输 送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。 高效液相色谱法是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色 谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀， 小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液

相色谱法（High Pressure Liquid Chromatography, HPLC)。又因分析速度快 而称为高速液相色谱法（High Speed Liquid Chromatography, HSLP)。也称

现代液相色谱[66_67]。

HPLC有以下特点[67]:

高压——压力可达150〜300Kg/cm2。色谱柱每米降压为75Kg/cm2以上。 高速流速为0.1〜10.0 mL/min。

高效一可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。

高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达O.Olng。同时消耗样品少。

HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：

速度快通常分析一个样品在15~30 min,有些样品甚至在5 min内即

可完成。

分辨率高——可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。

灵敏度高——紫外检测器可达〇.〇lng，荧光和电化学检测器可达O.lpg。 柱子可反复使用一用一根色谱柱可分离不同的化合物。

样品量少，容易回收——样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组 分或做制备。

高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱 法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法[68]。

(1)液固色谱法使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是 根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附一解吸附的 平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度5〜10pm。适用于分离分子 量200〜1000的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾。 常用于分离同分异构体。

(2)液液色谱法使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于

21

担体表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相 中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。

涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必须预先用固定相饱和，以减 少固定相从担体表面流失；温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子 的变化；另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化。由于 涂布式固定相很难避免固定液流失，现在已很少采用。现在多采用的是化学 键合固定相，如c18、c8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。

液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法和反相色谱 法。

正相色谱法采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动 相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异 丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性 和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。

反相色谱法一般用非极性固定相（如c18、c8);流动相为水或缓冲液， 常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节 保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。反相色谱法在现代液相 色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。

随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，聚丙烯酰胺水凝胶中丙烯酰胺单体的提取及高效液相色谱测定,现已应用于 某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓 冲液控制流动相的pH值。但需要注意的是，（：18和C8使用的pH值通常为 2.5〜7.5 (2〜8)，太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱 落。有报告新商品柱可在pH 1.5〜10范围操作。

(3)离子交换色谱法固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交 联形成的聚合物骨架，在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基（称阳离子交换

树脂）或季氨基（阴离子交换树脂）。被分离组分在色谱柱上分离原理是树脂 上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交 换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。

缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。被分离组分在离子交换柱中的保 留时间除跟组分离子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关外，它还受流动 相的pH值和离子强度影响。pH值可改变化合物的解离程度，进而影响其与 固定相的作用。流动相的盐浓度大，则离子强度高，不利于样品的解离，导 致样品较快流出。

离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。

(4)离子对色谱法又称偶离子色谱法，是液液色谱法的分支。它是根 据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后，在非极性固 定相中溶解度增大，从而使其分离效果改善。主要用于分析离子强度大的酸 碱物质。

分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、辛烷磺 酸钠等。另外高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对。

分析酸性物质常用四丁基季铵盐，如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐。

离子对色谱法常用ODS柱（即C18)，流动相为甲醇-水或乙腈-水，水中 加入3〜10 mmol/L的离子对试剂，在一定的pH值范围内进行分离。被测组 分保留时间与离子对性质、浓度、流动相组成及其pH值、离子强度有关。

(5)排阻色谱法固定相是有一定孔径的多孔性填料，流动相是可以溶 解样品的溶剂。小分子量的化合物可以进入孔中，滞留时间长；大分子量的 化合物不能进入孔中，直接随流动相流出。它利用分子筛对分子量大小不同 的各组分排阻能力的差异而完成分离。常用于分离高分子化合物，如组织提 取物、多狀、蛋白质、核酸等。

23

4.2高效液相色谱对丙烯酰胺的检测

用于丙烯酰胺直接测定的液相方法普遍采用反相色谱，选用非极性的C18 柱或等效柱（同时使用保护柱）。Ono等[69]曾尝试采用强极性的石墨化炭黑 柱，结果不理想：一方面干扰物质在MS-MS条件下产生与丙烯酰胺相同的 子离子；另一方面丙烯酰胺及干扰物的保留时间在同一型号的不同柱子上每 次都有较大的漂移。C18柱广泛应用于各类物质的测定，可供选择的色谱柱种 类繁多。不同厂家提供的C18柱性能、特点各有不同。在具体的应用中，不 同的研究人员采用不同的色谱柱，不同的流动相。如？0八[53]采用Aqua C18 (250mmx2mm)，流动相为水（0.1%乙酸，0.5%甲醇）；Rosen[51]米用 Hpercarb 50mmx2.1mm)，保护柱10mmx2.1mm)，流动相为甲醇-水 (20: 80); Tareke[5Q]米用 Hpercarb50mm><2.1mm)，流动相为水;

Ono 米用 Atlantis dCi8 (5[j_m，150mm><2.1mm)，保护柱为 OptiGuard mini (15mmxl.〇mm)，流动相为甲醇-水（10: 90)。

Ono 等选用的 Atlantis dCi8150mm><2.1mm)耐受有机溶剂，且

有机溶剂的使用延缓了丙烯酰胺的出峰时间，提高了样品的挥发性，使得离 子化效率进一步提高。各种色谱柱分离效果的差异说明无论选择那种色谱柱， 均应验证后使用。

日本国家卫生研究所（National Institute of Health Sciences)将一种新型

色谱技术应用于丙烯酰胺的测定——柱切换技术与质谱联用[58]。这种方法采

用四根色谱柱串联的方式实现，四根色谱柱一次为：柱1Hpercarb (5pm，

50mm><2.1mm)，柱 2Shodex Mspak GF-310 4B50mmx4.6mm),

柱 3Atlantis dC18 ( 5[j_m , 150mm><2.1mm )，柱 4Develosil

RPAQUEOUS-AR-3 (3pm，35mmx2.0mm)。色谱条件为柱温箱：柱 1〜3 为 40°C，柱4为室温;流动相：含0.1%乙酸的甲醇-水（5: 95);流速:0.25mL/min;

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柱切换：柱1—柱2为1.75〜2.05min，柱2—柱3为4.66〜5.15min，柱4(流 出）为 8.5min。

采用凝胶柱作为净化手段，与分析柱RP-18 GP ((：18柱）串联，再与质 谱联用，实现在线净化-分离，大大缩短了分析周期[™]。除了上述介绍的方法 以外，有实验室[71]采用离子排阻色谱柱作为分析柱，紫外检测器测定食品中 的丙烯酰胺。

综上所述，聚丙烯酰胺及其水凝胶有着广泛的应用，并且在很多行业中， 人们因为担心其可能降解而产生对人或动物有害的物质，所以对其应用的各 个领域中可能的降解进行了广泛的研究。对于临床医学中聚丙烯酰胺水凝胶 注射隆乳的应用，由于其植入体内后与人体组织永久接触，因此对其在人体 中稳定性的问题就更加值得关注，而且鉴于聚丙烯酰胺水凝胶隆乳后产生诸 多并发症，就不得不怀疑其在人体组织复杂的生物环境中是否能长期稳定存 在。聚丙烯酰胺在一定的条件下可以发生降解，其降解产生的丙烯酰胺单体 又对人体有明确的毒性，它是否与诸多并发症有联系呢？以往的研究没有给 出明确的答案，其主要原因是样品处理和检测分析手段难以让人信服。本课 题希望对聚丙烯酰胺水凝胶中丙烯酰胺单体的提取及HPLC检测方法的研究 对丙烯酰胺单体进行检测并准确定量，从而就上述疑问给出一个满意的答案。

25

正 文

实验一聚丙烯酰胺水凝胶中丙烯酰胺单体的提取与净化

聚丙烯酰胺水凝胶是由丙烯酰胺、N,N’-亚甲基双丙烯酰胺作为交联剂共 聚合而形成网状分子，可与大量水结合，溶胀形成水凝胶状物，但其不能溶 于水。如果按常规方法来提取丙烯酰胺，凝胶体将使提取过程难以进行，如 食品行业中丙烯酰胺的提取方法，很难使丙烯酰胺单体完全提取出；另外， 从人体中取出的聚丙烯酰胺水凝胶由于与体液进行交换而含有多种复杂化学 成分，影响丙烯酰胺的纯化。本实验比较了几种常见提取方法的回收率，以 找到最佳的丙烯酰胺提取方法。

1试剂与仪器 1.1试剂

丙烯酰胺（99.5%，优级纯，陕西中美生物科技有限公司）；

甲醇（色谱级，Fisher Scientific公司，美国）；

二次蒸馏水；

医用聚丙烯酰胺水凝胶（奥美定，吉林富华医用高分子材料有限公司）。 1.2仪器设备

BR4i高速台式离心机（Thermo Electro公司，美国）；

MTN-2800D氮吹浓缩仪（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；

梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司AL204电子天平；

大旋转过滤管，0.45 umPVDF (Alltech公司，美国)；

Oasis HLB6cc(200mg)固相萃取柱（Waters 公司，美国)；

26

Bond Elut-Accucat (mixed mode, Cs, SAX and SCX) 3mL 固相萃取柱 (Varian公司，美国）；

SKY-100B恒温培养摇床（上海苏坤实业有限公司）；

KQ-100DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；

Milli-Q超纯水装置（美国Millipore);

ASE200快速溶剂萃取仪，配有llmL不锈钢萃取池，60mL收集瓶（美 国戴安公司）。

1.3溶液配置

丙烯酰胺标准溶液的配置：准确称取适量的丙烯酰胺标准品（精确至 O.lmg)，聚丙烯酰胺水凝胶中丙烯酰胺单体的提取及高效液相色谱测定,用水溶解，配制成质量浓度为l.〇xl〇_4g/mL的标准储备液，根据需 要用水稀释成适宜浓度的标准工作溶液。所有配置溶液在用于高效液相色谱 前均经过0.45pm的微孔滤膜过滤。

2实验方法

2.1超声辅助甲醇萃取法 2.1.1萃取方法

(1)准确称取lg聚丙烯酰胺水凝胶；

(2)少量多次加入甲醇9mL，边加入边搅拌，直至凝胶体由透明胶状转变 为白色颗粒状；

(3)将上面得到的混合液密封，置于超声清洗器中30min;

(4)于离心机中9000转/min离心15min;

(5)小心倒取上清液于带有0.45pm膜的大旋转过滤管中，9000转/min过滤 离心5min;

(6)取出过滤液，置于氮吹仪下，常温吹干；

27

(7)加水至2mL，准备下一步净化处理。

2.1.2净化方法

(1)按顺序加入3.5mL甲醇、3.5mL蒸馏水，准备OASIS固相萃取柱，将

滤过液丢弃；

(2)加入2.1.1最终得到的1.5mL提取液于OASIS固相萃取柱，使之完全通 过，丢弃滤过液；

(3)用0.5mL蒸權水洗柱并丢弃；

(4)再用1.5mL蒸馆水洗柱并收集洗脱液，为过Varian固相萃取柱做准备， 注意上述每一步都不要用负压或正压方式加速洗脱过程；

(5)在Varian固相萃取柱吸附床上lmL处做标记；

(6)按顺序加入2.5ml甲醇、2.5ml蒸馆水，准备Varian固相萃取柱，并丢

弃过滤液；

(7)将步骤（4)中得到的1.5mL提取液加入到Varian固相萃取柱中，当液 面降至lmL标记处时开始收集洗脱液，最终得到lmL洗脱液，待HPLC检 测或浓缩后检测。

2.2 ASE 法 2.2.1萃取方法

(1)准确称取lg聚丙烯酰胺水凝胶；

(2)加入10g匀质沙粒混合搅拌至均匀；

(3)将样品沙粒混合物转移到不锈钢萃取池；

(4)将萃取池放入ASE快速溶剂萃取仪中进行萃取；

(5)ASE萃取仪条件：

系统压力：lOMpa (1500psi)

温度：80°C

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加热时间：5min 静态时间：5min

溶剂：甲醇 冲洗体积：10%

氮气吹扫：IMpa (150psi)，60 秒

(6)最后收集得到2mL萃取液，待进一步净化。

2.2.2净化方法 同 2.1.2。

2.3水浸泡萃取法 2.3.1萃取方法

(1)准确称取O.lg聚丙烯酰胺水凝胶；

(2) 加蒸馏水至10mL，37°C恒温振荡72小时；

(3)9000转/min离心30分钟;

(4)取上清液2mL。

2.3.2净化方法

同 2.1.2。

2.3.3后续处理

(1)置于氮吹仪下完全吹干；

(2)加入50^L蒸馏水待测。

2.4 HPLC检测条件

色谱柱为 AngilentTC-Ci8柱（5(j_m，150mmx4.6mm)，流动相为 100%水; 流速lmL/min;紫外线检测波长210nm;进样量20pL;柱温为室温。

2.5回收率测定方法

(1)取未植入人体的聚丙烯酰胺样品3份，每份均经上述3种样品前处理方

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法处理后，进行HPLC检测，重复进行3次，计算平均值、标准差；

(2)按3份样品检测的浓度由低到高分别添加0.2、1、5)ig/mL三种不同浓 度丙烯酰胺标准溶液后，密闭避光放置24h，使凝胶与丙烯酰胺标准溶液充 分混合；

(3)按同样的3中样品前处理方法分别处理加标样品，再行HPLC测定，每 个样品测定3次，计算平均值与标准差；

(4)最后计算加标回收率。

3结果与讨论

3.1 3种样品前处理方法回收率比较

加标回收率结果如表1-1〜3所示：

表1-1超声辅助甲醇萃取法丙烯酰胺回收率

序号-AM 含量（jig/mL)回收率（％)

加标前加标量加标后

10.123 士 0.0110.20.211 士 0.01344.2 士 6.5

20.295士 0.0161.00.865士 0.03057.0 士 3.0

30.546士 0.0235.04.047士 0.08870.0 士 1.8

表1-2水浸泡萃取法丙烯酰胺回收率

序号-AM 含量（jig/mL)回收率（％)

加标前加标量加标后

10.248士 0.0140.20.424士 0.01787.8 士 8.3

20.467士 0.0191.01.382士 0.03491.5 士 3.5

30.727士 0.0265.05.473士 0.11394.9 士 2.3

30

表1-3 ASE法丙烯酰胺回收率

AM 含量（(ig/mL)

序号

加标前

加标量

加标后

回收率（％)

10.102 士 0.0090.20.174 士 0.01136.2 士 5.7

20.252士 0.0131.00.739士 0.02748.7 士 2.7

30.513 士 0.0215.03.725士 0.07064.2 士 1.4

3种方法的回收率比较如图1-1所示:

m

o

4D; ■

w

M—

嘴

2D.

n

Me^n +-1

处

0,2

1,0

5-.0

u.............||............

图1-13种样品前处理方法回收率比较图

水浸泡萃取法的回收率明显高于其他两种方法。根据聚丙烯酰胺水凝胶 的特性及丙烯酰胺在水中溶解度最大，过量的水使聚丙烯酰胺水凝胶达到完 全的溶胀状态，丙烯酰胺单体则在水凝胶内、外水中达到平衡，这样就可以

31

通过测定提取液中丙烯酰胺的含量间接得出聚丙烯酰胺水凝胶中丙烯酰胺单 体的准确含量，通过对检测基质的替换，不但极大地简化了样品处理过程， 而且加标回收率实验也获得了满意结果。

3.2净化方法的选择

在从样品中提取丙烯酰胺单体的过程中，特别是从人体取出的样品，不 可避免地会将人体体液内的某些有机和无机成分一起提取出来。这些内源性 杂质如果不经过净化处理，在进入HPLC检测时，可能会堵塞色谱柱，影响 其使用寿命，而且可导致色谱图干扰峰较多，基线不稳定，影响检测结果， 所以必须通过净化处理来去除这些杂质。

传统的净化手段是反复的液一液萃取，手续复杂、耗时、有机溶剂消耗 量大，聚丙烯酰胺水凝胶中丙烯酰胺单体的提取及高效液相色谱测定,且被测物在液一液萃取过程中损失较大，不利于微量物质的检测。固 相萃取方法（SPE)具有消耗溶剂量少、对样品污染少、处理时间短、被测 物的损失小等特点，目前已成为纯化样品中待检成分的有效方法。

本实验所选用的Oasis HLB 6mL ( 200mg )固相萃取柱和Bond Elut-Accucat (mixed mode, Cs, SAX and SCX) 3mL (200mg)固相萃取柱， 是美国FDA公布的食品中检测丙烯酰胺标准方法中所采用的固相萃取柱。通 过实验证明联合应用两种固相萃取柱，可以快速、有效地去除提取液中的杂 质，色谱峰形好，基线平稳，杂质峰干扰少，定量准确。对应用与未应用两 种固相萃取柱的比较见图1-2〜3。

32

20 -

图1-3应用两种固相萃取柱的样品色谱图

33

阁1-2米K、/:川|构种N相草収朴:的样品色记浪

有文献报道，在食品中检测丙烯酰胺，单纯使用Oasis HLB 固相萃取柱也可以获得满意的效果。本实验也曾尝试应用，但在 色谱图上出现较多的杂质峰干扰，造成定量困难，这可能与测试 基质不同，因而杂质成分不同有关。联用两种固相萃取柱对提取 液进行净化，分离杂质完全、彻底，纯化被测物效果好。虽然增 加一个柱子增加了丙烯酰胺的损失，但避免了色谱图的杂质峰干 扰，不失为一种较好的选择。

34

实验二聚丙烯酰胺水凝胶中丙烯酰胺的HPLC检测

过去有学者曾采用HPLC的方法对聚丙烯酰胺中的丙烯酰胺进行检测 [22-72_M，但样品前处理方法不统一，且提供的方法不很明确，结果的说服力 不足。本实验采用实验一中水浸泡萃取法进行样品前处理，对丙烯酰胺的 HPLC检测方法进行全面的研究，建立了准确、有效的丙烯酰胺HPLC检测 方法，可以客观的对聚丙烯酰胺中的丙烯酰胺含量进行分析。

1伩器与设备

HP1100型高效液相色谱仪，配有紫外检测器、二元梯度泵、20pL定量 环；

色谱柱：150mm><4.6mm，粒度 5|am，填料：AngilentTC-Ci8;

BR4i高速台式离心机（Thermo Electro公司，美国）；

MTN-2800D氮吹浓缩仪（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；

梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司AL204电子天平；

大旋转过滤管，0.45 pmPVDF (Alltech公司，美国)；

Oasis HLB 6cc (200mg)固相萃耳又柱（Waters公司，美国)；

Bond Elut-Accucat (mixed mode, C& SAX and SCX) 3mL 固相萃耳又柱 (Varian公司，美国）；

SKY-100B恒温培养摇床（上海苏坤实业有限公司）；

Milli-Q超纯水装置（美国Millipore);

丙烯酰胺（99.5%，优级纯，陕西中美生物科技有限公司）；

甲醇（色谱级，Fisher Scientific公司，美国）;

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二次蒸馏水；

医用聚丙烯酰胺水凝胶（奥美定，吉林富华医用高分子材料有限公司）； 从患者体内抽出的聚丙烯酰胺水凝胶。

所有配置溶液在用于高效液相色谱前均经过0.45pm的微孔滤膜过滤。

2实验方法 2.1样品处理方法 2.1.1提取方法

(1)准确称取lg聚丙烯酰胺水凝胶或从人体中取出的聚丙烯酰胺水凝胶， 加蒸馏水至10mL，37°C恒温振荡24小时；

(2)于离心机中9000转/min离心30分钟;

(3)取上清液2mL，待下一步净化。

2.1.2净化方法

(1)按顺序加入3.5mL甲醇、3.5mL蒸馏水，准备OASIS固相萃取柱，将

滤过液丢弃；

(2)加入2.1.1最终得到的1.5mL提取液于OASIS固相萃取柱，使之完全通 过，丢弃滤过液；

(3)用0.5mL蒸權水洗柱并丢弃；

(4)再用1.5mL蒸馆水洗柱并收集洗脱液，为过Varian固相萃取柱做准备， 注意上述每一步都不要用负压或正压方式加速洗脱过程；

(5)在Varian固相萃取柱吸附床上lmL处做标记；

(6)按顺序加入2.5mL甲醇、2.5mL蒸馆水，准备Varian固相萃取柱，并

丢弃过滤液；

(7)将步骤（4)中得到的1.5mL提取液加入到Varian固相萃取柱中，当液

面降至lmL标记处时开始收集洗脱液，最终得到lmL洗脱液，待HPLC检 测或浓缩后检测。

2.2 HPLC分析条件

色谱柱为 AngilentTC-Ci8柱（5(j_m，150mmx4.6mm)，流动相为 100%水； 流速lmL/min;紫外线检测波长210nm;进样量20pL;柱温为室温。

3结果与讨论

3.1样品处理方法的选择

样品处理方法采用实验一中的水浸泡萃取法。

浸泡时间的选择。选定以水作为萃取溶剂后，又对不同浸泡时间的提取 效率再次进行比较，检验浸泡时间对提取效率是否有影响，并以此为基础选 出最佳的浸泡时间。取有代表性的聚丙烯酰胺水凝胶样品，按浸泡时间1、3、 5天分为三组，每组6份平行样品，其中3份样品加入等量的丙烯酰胺标准 溶液用以测定加标回收率，所有样品密封后放入恒温培养摇床，室温，避光， 60转/min,分别于1、3、5天后取一组样品，离心后取上清液，0.45—的 PVDF膜离心过滤，过Oasis HLB及Bond Elut-Accucat固相萃取柱净化，最 终的洗脱液入HPLC检测。不同浸泡时间的加标回收率结果见表2-1。

表2-1不同浸泡时间回收率对比

浸泡时间（天）回收率（％)

188.3 土 5.5

393.5 土 2.4

593.7 土 2.1

37

回收率结果显示*浸泡时间为1天时，其回收率与3天和5天相比有明 显差鹿，且标准差较大，测定值不稳定，说明浸泡1天还无法使丙烯酰胺达 到稳定的平衡分布。而3天和5天的'回收率结果没有明显差距，且测定值稳 定，结合实验周期的考虑，浸泡3天无疑是更简单、高效的方法，匪此本实 验选择3天为最佳的样品浸泡时间。

3.2方法确证 3.2.1线性关系

分别适暈吸取己配制的丙烯酰胺（lmg/mL)，用水逐级稀释，配制成标 样浓度为0.05、0.5、1.0、10、50、100|ig/mL，在所选择的色谱条件下进样， 以标样浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。其标准曲线、回 归方程、相关系数如图2-1所示。

 

丙烯酰胺浓度（M*g/ml)

图2-1丙烯酰胺的标准曲线及相关系数

38

结果表明，当丙烯酰胺含量为0.05-100|ig/mL时，聚丙烯酰胺水凝胶中丙烯酰胺单体的提取及高效液相色谱测定,丙烯酰胺峰面积（y) 和丙烯酰胺标准溶液浓度（|ig/mL)呈良好的线性关系，线性方程为：y = 122.59x- 18.398，相关系数 R2= 0.9997。

3.2.2最小检出限（LOD)和最小定量限（LOQ)

取低浓度丙烯酰胺标准溶液，用水逐级稀释并进样测定，以信号噪声比 (S/N)等于3为基准，测得该条件下丙烯酰胺的最小检测限为0.05)ig/mL; 以信号噪声比等于10为基准，测得丙烯酰胺的最小定量限为O.lSug/mL。最 小定量限〇.15|ig/mL与0.5|ig/mL色谱图分别见图2-2、3。

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图2-30.5|ig/mL丙烯酰胺标准溶液色谱图

3.2.3精密度及稳定性实验

取0.2、1、5)ig/mL的丙烯酰胺标准溶液分别代表低、中、高浓度，各浓 度溶液分别连续进样6次，计算得到三个浓度测定数值的相对标准偏差 (RSD)分别为4.7%、3.3%和2.4%。取聚丙烯酰胺水凝胶样品一份，按优 化后的方法进行样品预处理，于1天内的6个不同时段进行HPLC分析；同 时，分8天连续测定，取平均值并计算RSD值。其日内和日间RSD值分别 为5.6%和6.7%，具体检测数据见表2-2〜4。

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表2-2三个浓度梯度丙烯酰胺标准溶液的检测数据及RSD值

表2-3样品日内测定数值及RSD值

样品丙烯酰胺单体含量（Hg/mL)平均值RSD

12 3 4 56(jig/mL)(%)

聚丙烯酰 胺水凝胶0.4280.416 0.380 0.402 0.3680.3910.3985.6

表2-4样品日间测定数值及RSD值

样品_丙烯酰胺单体含量（Hg/mL)平均值RSD

12 3 4 5 670 (ng/mL) 〇丨（％)

聚丙烯酰 胺水凝胶0.3510.374 0.326 0.389 0.385 0.3420.3670.332 0.3586.7

丙烯酰胺浓测定浓度（|ig/mL)平均值

(ng/mL)RSD

(%)

度(jig/mL)123456

0.20.2120.1980.1890.2060.2090.1920.2014.7

1.00.9771.0450.0280.9940.9570.9890.9983.3

5.05.1045.0364.8875.0825.1394.8525.0172.4

3.2.4回收率实验

对3瓶医用PAMG产品，各取3份按实验一中水浸泡萃取法进行样品处 理并行HPLC检测；再各取3份按上步检测得到的浓度由低到高，分别添加 AM标准溶液0.2、1.0、5.0|ig/mL，聚丙烯酰胺水凝胶中丙烯酰胺单体的提取及高效液相色谱测定,用同样方法进行处理、HPLC测定，得平

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均回收率>87%，如表2-5。

表2-5丙烯酰胺回收率

AM 含量（(ig/mL)

加标前加标量加标后

序号

回收率（％)

10.248士 0.0140.20.424士 0.01787.8 士 8.3

20.467士 0.0191.01.382士 0.03491.5 士 3.5

30.727士 0.0265.05.473士 0.11394.9 士 2.3

3.5实际样品检测

对未植入人体聚丙烯酰胺水凝胶5份样品进行检测，每份样品重复测定 3次，检测结果为0.2〜0.8ng/mL，如表2-6所示；对从人体中取出聚丙烯酰 胺水凝胶5份样品进行检测，均低于最小检出限。标准曲线及部分样品检测 色谱图见图2-4〜6。

表2-6水凝胶样品检测数据

样品编号丙烯酰胺含量（Hg/mL)

IIIIII平均值（|ig/mL)

10.3390.3080.3210.323

20.6870.7260.6590.691

30.2630.2940.2850.281

40.3430.3610.3270.344

50.5010.4520.4680.474

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图2-4聚丙烯酰胺水凝胶样品1 HPLC色谱图

图2-5聚丙烯酰胺水凝胶样品3 HPLC色谱图

43

 

图2-6聚丙烯酰胺水凝胶样品4 HPLC色谱图

44

 

小 结

本课题通过对超声辅助甲醇萃取法、水浸泡萃取法和ASE法三种样品 前处理方法，聚丙烯酰胺水凝胶中丙烯酰胺单体的提取及高效液相色谱测定,得出水浸泡萃取法是一种简单、有效的提取聚丙烯酰胺水凝胶 中丙烯酰胺的方法。高效液相色谱检测对丙烯酰胺的定性准确，提取效率高， 结果可靠。较其他方法步骤少、操作简单、回收率高，适用于聚丙烯酰胺水 凝胶中丙烯酰胺单体含量的检测。对植入与未植入人体的聚丙烯酰胺水凝胶 进行检测，结果提示，植入人体的聚丙烯酰胺水凝胶在人体内未大量降解及 局部蓄积，且丙烯酰胺含量低于植入前水平，可能因为聚丙烯酰胺水凝胶中 的水份在人体组织复杂的生物环境中与体液进行交换，丙烯酰胺自由扩散， 被组织吸收、代谢使之含量减少。对于临床出现的多种并发症，可能不是残 留单体单独作用的原因，可能与其他因素有关。因此，对于其可能含有的其 他化学成分，以及水凝胶大分子结构的微观变化及其长期的变化仍需进一步 探讨。由于对从人体中抽出的聚丙烯酰胺水凝胶的检测结果均低于最小检出 限，所以有待于对丙烯酰胺更低浓度的检测方法的建立。

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