微卫星序列又称简单序列重复（Simple sequ¬ence repeat, SSR) ， 是广泛分布于真核生物基因组 中的高度重复序列。在动植物研宄方面，目前已成 为遗传连锁分析、基因定位以及遗传标记图谱构建 等领域一个极为重要的研究手段典型的微卫星 DNA重复单位的核心序列为2~6 bp,重复次数为 10~20 次，长度一般为 100~300 bp。

聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide gel elec- trophoresis, PAGE)技术由于其检测灵敏和分辨率高 的特点，特别适合于小片段多态性扩增产物条带的 检测，并且分离效果好，分辨率高。理论上，不同 浓度的凝胶在一定范围内，凝胶的浓度越大，分辨 率越高，对长度差异片段区分性越好，越有利于基 因型的判断。扩增片段检测目前主要采用溴化乙锭 (Ethidium bromide, EB)染色与硝酸银染色[3]。银染 由于染色背景较深，非特异性条带较多，品种之间 的特异性条带不易区分，不利于进行品种纯度方面 的鉴定分析[4];聚丙烯酰胺淬灭EB的荧光，使EB 染色的灵敏度降低，但是此方法操作时间短、程序 简单、背景颜色浅、成像容易，使得SSR扩增的 多态性目的条带带型清晰，数量也能够满足实验分    

析要求。另外，EB染色结果具有一致性，重复性 好的优点，马铃薯标记聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,成为品种鉴定方法中条带染色的首选方

法。

本试验拟通过对聚丙烯酰胺凝胶电泳参数的分 析，确立马铃薯品种纯度鉴定中标记产物的最佳电 泳体系，以满足试验分析的需要，同时为马铃薯主 栽品种DNA指纹图谱的构建打下理论基础。

i材料与方法

1.1试验材料

本试验选用的马铃薯为黑龙江省主栽品种，由 黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所提供(表

1)。

SSR标记所用引物序列由加拿大蒙特利尔麦吉 大学科研组提供(表2),并由上海生工生物技术公 司合成；其它试剂(TaqDNA聚合酶等)均购自大连 宝生物试剂公司。

表1试验用马铃薯品种

序号品种名称级别

1早大白原原种

2黄麻子原原种

3克新13号原原种

4荷兰15原原种

5大西洋原原种

 

表2 SSR标记所用引物序列情况

引物编号序列顺序(5'到30

SSI-FTCT CTT GAC ACG TGT CAC TGA AAC

SSI-RTCA CCG ATT ACA GTA GGC AAG AGA

Patatin-FCAA CCA ACA AGG TAA ATG GTA CC

Patatin-RTGG TCT GGT GCA TTA GAA AAA A

STM0014-FCAG TCT TCA GCC CAT AGG

STM0014-RTAA ACA ATG GTA GAC AAG ACA AA

UGP-FGAA ACT GCT GCC GGT GC

UGP-RTGG GGT TCC ATC AAA C

电泳操作如上，比较不同电压电泳结果的差异。

表3不同浓度聚丙烯酰胺凝胶的配制

凝胶浓度5%8%12%16%

30%丙烯酰胺储液(mD1.662.6645.2

5xTBE (mD2222

10%过硫酸胺（APS) (pL)100100100100

四甲基乙二胺(TEMED) (pD10101010

双蒸水(mL)6.845.8442.8

分离的DNA大小(bp)80-50060-40040-20020-100

 

1.2试验方法

1.2.1马铃薯块茎DNA提取

米用Isolation buffer提取液提取马铃著DNA， Isolation buffer 提取液配方如下：100 mM Tris (pH 8.0) , 50 mM EDTA (pH 8.0) , 1.3 M NaCl, 0.2% SDS, 0.5% Triton X-100, 1% PVP, 10 mM DTT, 60 mM b-mercapto ethanol,其它操作步骤同 一般SDS提取方法R6]，并用Alpha Innotech公司的 December 2006型紫外凝胶成像仪检测结果。

1.2.2SSR 标记

PCR反应体系(20 |xL): lOxPCR 缓冲液 2 |xL, 10 mM dNTPs 0.8 )xL, 25 mM MgCl2 2.4 (xL, Taq DNA 聚合酶（5 U /fxD 0.15 |xL, 4mM上游引物1 |xL, 4mM下游引物1 |xL,灭菌双蒸水11.65|xL,模板DNA60ng。

PCR扩增程序：

95T：预变性5 min; 94T；变性30 s, 48.5丈复 性45 s, 72X：延伸90 s,共35个循环；72T；延伸 7 min,在 Biometre 公司 T-Gradient Thermoblock 型 号PCR扩增仪上扩增，产物4丈保存。

PCR产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，EB染 色，紫外凝胶成像仪检测结果。

1.2.3聚丙烯酰胺凝胶电泳参数分析

(1)不同浓度的聚丙烯酰胺凝胶电泳比较

分别配制5%、8%、12%、16%的聚丙烯酰 胺凝胶，所需各种试剂及用量如表3，预电泳 30 min 后，取 PCR 产物 5|xL 与 l|xL 6-Loading Buffer混匀，上样，电泳，EB染色，紫外凝胶成 像仪检测结果。

(2)电压变化对电泳结果的影响

设置电压梯度为330V、250V、170V、90V,

(3)凝胶染色方法比较

①银染方法：

A.银染液的配制：固定液（100 mL冰乙酸加水 稀释至 1 000 mL);染色液（2g AgN03、1.5 mL 37%甲醛，加水稀释至1 000 ml);显色液（30 g Na2C03、1.5mL37% 甲醛、0.2mLNa2S2O3，加水 稀释至1 000 mD ;终止液（10%冰乙酸。

B银染法操作：固定30 min—去离子水洗涤5~ 10 min—染色30 min—去离子水洗涤2次(每次不 超过30 a)—显色至所要程度—终止显影。

②溴化乙锭(EB)染色：

将EB贮液（10 mg*mL-〇用双蒸水稀释至 0.5将电泳后的凝胶放入染色液中30

min,染色后的凝胶放入蒸馏水中清洗5 min,再 将凝胶放入紫外凝胶成像仪观测结果。

2结果与分析

2.1 DNA提取结果

将5个马铃薯品种提取的DNA,各取5 jxL， 与1 |JLL 6-Loading Buffer混勾，马铃薯标记聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,用1%琼脂糖凝胶， 100 V电压，电泳30 min,结果用紫外凝胶成像仪 检测。从电泳结果可以看出，用Isolation buffer提

取液提取的马铃薯DNA,质量好，主带唯一，无 拖尾和弥散，能够满足SSR标记的要求（图D。

2.2不同参数电泳结果比较

2.2.1不同浓度的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果

不同浓度的聚丙烯酰胺凝胶，凝胶的孔径大 小、分辨率不同，分离效果也明显不一样（图2)。 凝胶浓度较低时_5%,胶的分辨率明显不好，SSR 标记扩增的多态性条带数量少，带型模糊，不利于 带型区分、品种区分；12%和8%浓度的凝胶相比， 多态性条带数量多，带型清晰，品种之间的区分更 明显；16%浓度的凝胶电泳，多态性条带数量并没 有较12%浓度的凝胶有明显的增加，并且由于电泳 时间过长，单一条带反而有些离散，不如12%浓 度的凝胶条带集中、明亮，同时配制16%浓度的 凝胶所需要的相关试验试剂的用量也比较大，试验 成本也会相应增加。 

 

2.2.2不同电压下的电泳结果

在实际电泳操作中，不同电压下的电泳对应的 时间、电流参数如表4。

表4不同实际操作电压下的时间、电流参数值

申压CV)工作参数

电流(mA)时间(min)

3309280

25057150

17046260

9026460

在330V电压下，电泳只需要80 min就能完 成，但是因为电泳速度过快，标记的多态性条带不

能完全分离开来，并且条带不清悉；90 V电压下， 电泳结果比较好，能够满足实验分析的需要，但是 电泳时间太长，接近8个小时；250 V、170 V电 压均能将泳道中的多态性条带分开，满足试验分析 的需要，并且，170 V电压电泳，多态性条带更清 晰，可以采用（图3)。

2.2.3PCR标记产物不同染色方法的结果比较 EB染色，多态性条带清晰，背景浅，并且同 一品种多次扩增成像一致，便于实验结果分析；银 染法随着时间的增长，背景逐渐加深，显示的多态 性条带数目增多，目的条带相近的细小条带（俗称 影子带）也在増多，若对目的条带带型不是很了 解，马铃薯标记聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,则不利于基因型的判断，对多态性信息量、简 单匹配系数等的试验分析也容易出现错误。

果如图4。 

200

100

 

图4SSR标记产物不同染色方法结果比较

1 一标记产物EB染色结果；2—银染20 min结果；

3—银染30 min结果；4一银染50 min结果；5—银染70 min结果。 (泳道马铃薯品种顺序与表1相同，M为标准分子质量 

3结果与讨论

SSR标记与其它标记方法（RFLP、RAPD、 AFLP等)相比，具有共显性遗传，符合孟德尔遗传 规律，数量丰富，分布均匀，覆盖整个基因组， 试验重复性好，结果可靠性高等优点[7,8]，是马铃 薯品种纯度鉴定分析的理想的分子标记。SSR标记 结合聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的检测方法， 聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨力极高，用于测序的聚 丙烯酰胺凝胶可分离相差1 bp的DNA片段，能 够将品种特异性的谱带分离出来，进而判定纯度 和真实性。但是对凝胶结果影响因素较多，不同 的试验处理对成像结果都有影响，影响大g 于不能进行试验结果的分析，因此，需要^ 烯酰胺凝胶电泳参数进行优化，聚丙烯酰胺凝胶的 浓度、电泳时间都是其中重要的参数，试验结果表 明：在聚丙烯酰胺凝胶的浓度为12%、电泳电压 为170V的情况下，马铃薯标记聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,PCR标记产物多态性条带清晰、 明亮、稳定，便于试验分析与交流。PCR扩增产 物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，目标产物的检测 主要采取显色法。目前大多采用同位素放射自显影 法、荧光染料标记法、EB染色法和银染法，放射 自显影法操作过程比较繁琐，且操作者容易遭受同 位素照射的危险，在推广应用中有一定的难度；荧 光染料标记法操作过程同样繁琐，试验成本较高; 银染法其检测的灵敏度接近于同位素检测，但是整 个银染检测操作步骤也非常繁锁，染色花费的时间 也较长(染色1次约需要2 h),同时，使用到的配 制试剂较多，试验稳定性也难以控制，不利于品种 鉴定[9]; EB染色法方便易行，时间短，全程只需要 35 min,操作比较简单，只需要配置一种溶液，采 用两个步骤，紫外凝胶成像仪成像方便，并且EB 染色结果稳定，利于试验分析。但是EB具有致癌 性，对人身体健康有害，因此，找到一种更好的染 色方法，既有利于试验分析，又不危害身体，对 SSR标记方面的研究是非常必要的。