聚合物降解菌的分离筛选及鉴定，聚丙烯酰胺是一种高分子量的聚合物，常规菌种降解难度很大。本研究通过采自聚 合物含量高的陕北油田地区的泥浆池废液和周边土壤中的样品，分离筛选对聚丙烯酰胺 环境有高度适应能力和对聚合物有降解潜力的菌株，并对最终得到目标菌种进行分离鉴 定。

1实验材料

1.1菌种来源

菌种由陕西长庆43-1号油田泥浆池废液和4-23号油田废弃泥浆池周围土壤中分别分

离筛选得到。 1.2主要试剂与仪器

主要试剂列表如下:

表2-1主要实验试剂 Table2-1 Main Reagents

试剂名称生产公司

蛋白酶K西安润德生物技术有限公司

RNaseA西安润德生物技术有限公司

三（羟甲基）胺基甲烷（Tris)西安市雁塔区保昕化学试剂有限公司

十六烷基三甲基溴化胺（CTAB)陕西昕泰生物科技发展有限公司

十二烷基硫酸钠（SDS)西安润德生物技术有限公司

聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP)西安永屹生物技术有限公司

Tris饱和酚上海索莱宝生物科技有限公司

溴化乙锭i：EB)西安国安生物科技有限公司

其它试剂：氯化钠、乙酸钠、EDTA、氯仿、异戊醇、异丙醇、乙醇等，均为分析 纯。

主要仪器列表如下:

表2-2主要实验仪器 Table2-2 Main experimental apparatus

仪器名称生产公司

SartoriusBS210S 电子天平北尕赛文利斯天平有限公司

Eclipse E200 显微镜曰本尼康公司

显微摄像系统日本尼康公司

LDZX-40BI立式压力蒸汽灭菌锅上海申安医疗器械厂

GZX-DH400-BS-II电热恒温干燥箱上海跃进医疗器械厂

SXK-103超净工作台安徽蚌埠净化设备厂

DNP-9052细菌培养箱上海跃进医疗器械厂

ZHWY-A211C卧式旋转型摇床上海智城分析仪器制造有限公司

SPX-250IC人工气候箱上海博迅实业有限公司

PYX-DHS-35X40隔水式电热恒温培养箱上海市跃进医疗器械厂

手持式土壤PH测试仪广州铭睿电子土壤酸度计

土壤水份测定伩哈尔滨宇达电子技术有限公司销售部

1.3培养基

菌种筛选培养基。其组成如下：乳酸钠4ml，KH2P040.02g，聚合物降解菌的分离筛选及鉴定，NaCl 10g, MgS04 *7^0 为0.2g,维生素C0.2g，酵母膏l.Og,模拟水为1000ml的lg/LHPAM。灭菌冷却后加 入经紫外灭菌的FeS04(NH4)2S04 • 6H20。

实验用部分水解聚丙烯酰胺分子量1.7-2.2X107,水解度18.6-29.3%,高效pH范围 4-13,固含量之90%,残单0.05-0.15%,白色颗粒粉末，由巩义市拓普净水材料有限公司 提供。

富集培养基：在菌种筛选培养基中分别加0.1%酵母膏和0.1%蛋白胨，用于菌株的 平板培养和斜面保存。

细菌分离及斜面培养基：蛋白胨l〇g，牛肉膏4.5g,氯化钠5g，琼脂20g，蒸馏水 lOOOmL, pH 值 7.2〜7.5。

真菌分离及斜面培养基(PDA培养基):马铃薯200g煮出液，蔗糖20g，琼脂15〜20g， 蒸馏水1000 mL, pH值自然。

2实验方法

2.1菌株的富集

实验样品采自陕西长庆43-1号油田泥浆池废液周围土壤和4-23号油田废弃泥浆池 周围土壤的共4处采样点。采样方法：用小铁锹除去地面浮土后，取地表或地下10 cm 的土壤样品，置于-2(TC保存。

表2-3采集土壤特性

Table2-3 Collected soil characteristics

编号PH含水率

43-1号采样点18.558.3%

43-1号采样点28.898.5%

4-23号采样点18.3715.1%

4-23号采样点28.2115.6%

将所采集的HPAM污染土样称量10g,接入200mL已灭菌的富集液体培养基中， 在30°C旋转式摇床中(转速200 r/min)旋转培养4d后，移取一定量含菌的富集培养液接 入新鲜灭菌过的富集培养基中，在相同条件下培养4d，一共重复3次，得到富集的HPAM 降解混合菌。

2. 2菌株的筛选

取O.lmL菌液涂布于以HPAM为唯一碳源的筛选培养基上，30°C培养48h，待平板 长出菌落后选择生长良好且性状差异明显的菌落，连续平板划线纯化，将纯化的菌株转 接于筛选养基斜面培养Id后4"C保存于冰箱。

2. 3形态鉴定

根据《Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology》（Buchanan R.E. and Bergey N.E., 1994)和《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠和蔡妙英，2001)的方法，进行各菌株 的形态鉴定，包括细菌个体形态观察(革兰氏染色、芽孢染色和菌体大小等)和菌落形态 观察(菌落形态、菌落质地、菌落边缘、光学特性和菌落的颜色等)。

2. 4菌株的常规生理生化性质测定

挑取筛选到的菌株分别接入筛选养基中，在温度30°C、转速200 r/min的旋转式摇 床中摇瓶培养4d后，将得到的菌液在筛选养基平板上划线，并在30°C的细菌培养箱中 培养活化l-2d。选择活化良好的菌株作为实验菌株，参照《简明第八版伯杰细菌鉴定手 册》[48]《常见细菌系统鉴定手册》[49]对筛选的细菌进行生理生化性质测定，将细菌初步 鉴定到属。鉴定方法主要有革兰氏染色法、芽孢染色法、V-P实验、葡萄糖氧化发酵实 验、淀粉水解试验、甲基红试验、接触酶试验、明胶液化、半固体琼脂穿刺、细菌的运 动性观察、硫化氢反应等，各实验均重复3次。具体实验方法如下：

(1)革兰氏染色：挑取少量菌苔涂布在载玻片上，风千，在火焰上固定涂片，滴加结 晶紫染色1-2 min，水洗，滴加碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1 min,水洗。用滤纸吸 去载玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇 无紫色时，立即水洗。用番红液复染约2 min,水洗。干燥后，用油镜观察。菌体被染 成蓝紫色的为革兰氏阳性菌，被染成红色的为革兰氏阴性菌。

(2)芽孢染色：加1-2滴水于小试管中，用接种环挑取2-3环菌苔于试管中，搅拌均匀， 制成浓的菌悬液。加孔雀绿染液2-3滴于小试管中，并使其与菌液混合均匀，然后将试 管置于沸水浴的烧杯中，加热染色15-20 min。用接种环挑取试管底部菌液数环于洁净 载玻片上，涂成薄膜，然后将涂片通过火焰3次温热固定。水洗，直至流出的水无绿色 为止。用番红染液染色2-3 min，倾去染液并用滤纸吸干残液。干燥后用油镜观察。芽 孢呈绿色，芽孢囊及营养体为红色。

(3)尿素酶（Urease)试验：挑取培养了 18~24h的待试菌培养物接种于液体培养基管 中，摇均，于36°C各培养lOmin，60min和120min，分别观察结果。若结果为粉红色为、 则呈阳性。

(4)氧化酶（Oxidase)试验：在琼脂斜面上滴加试剂1〜2滴，数分钟内直接观察结果。 使用Kovacs氏试剂阳性者呈粉红色或深紫色，Ewing氏改进试剂呈蓝色。

(5)过氧化氢酶的测定：将测试菌种接种于合适的培养基斜面上，适温培养18〜24h。 取一干净的载波片，在上面滴1滴3〜10%的H202,挑取1环培养了 18〜24h的菌苔纯培 养，在H202溶液中涂抹，若有气泡出现，则为过氧化氢酶阳性，无气泡者为阴性。

(6)甲基红（Methyl Red)试验：挑取新的待试纯培养物少许，接种于MR-VP生化 鉴定管，在通用培养基30°C下培养3〜5天，从第二天起，每日取培养液lml,加入甲基 红指示剂1〜2滴，观察结果。阳性呈鲜红色，弱阳性呈淡红色，阴性为黄色。从发现阳 性开始到第5天仍为阴性的，即可判定结果。

(7)V-P试验：将实验菌接种于通用培养基于36°C培养48h,培养液lml加O’Meara 试剂lml，摇动试管1〜2min,静置于36°C恒温箱，若4h内不呈现伊红的红色即判定为 阴性，聚合物降解菌的分离筛选及鉴定，反之为阳性。

(8)葡萄糖的氧化发酵试验：以培养18〜24h的幼龄菌种，穿刺接种在基础培养基中， 每株菌接4管，其中2管用油封盖，以隔绝空气闭管。另2管不封油为开管，同时留有 不接种的闭管作为对照。适温培养1、2、4、7天观察结果。氧化型产酸：仅开管产酸。 发酵型产酸：开管及闭管均产酸。如产气，则在琼脂柱内产生气泡。

(9)硝酸盐（Nitrate)还原试验：临试前将试剂磺胺酸冰醋酸溶液和试液a —萘胺乙醇 溶液各0.2ml等量混合，取混合试剂约0.1ml，加于液体培养基或琼脂斜面培养物表面， 立即或于lOmin内呈现红色即为试验阳性，若无红色出现则为阴性。

(10)靛基质（Imdole)试验：将待测菌种接种于试验培养基管，于36°C培养24h时后， 先加少量乙醚或二甲苯，摇动试管以提取和浓缩靛基质，待其浮于培养液表面后，再沿 试管壁徐徐加入Kovacs氏试剂数滴，观察结果。若在试剂和培养基接触面上呈红色， 即为阳性。

(11)三糖铁（TSI)琼脂试验：以接种针挑取待试菌可疑菌落或纯培养物，穿刺接种 并涂布于斜面，置36°C培养18〜24h，观察结果。

(12)氨基酸脱羧酶的测定：用幼龄培养液作为菌种，直接接种。接种后封油，对照管 与测定管同时接种封油。肠肝菌科的细菌于37°C培养4天观察。当指示剂呈紫色或带红 色调的紫色者为阳性，呈黄色者为阴性。对照管应呈黄色反应。

(13)硫化氢（H2S)试验.•在含有硫代硫酸钠指示剂的培养基中，沿管壁穿刺接种于 36C培养24~28h,培养基呈黑色为阳性。阴性应继续培养至6天再观察结果。

(14)柠檬酸盐或丙酸盐的利用：取幼龄菌种接种于斜面上，适温培养3〜7天，培养基 呈碱性（蓝色）者为阳性反应，不变者则为阴性。

(15)葡萄糖酸盐的氧化：用pH7.2的磷酸缓冲液配制成含1%葡萄糖酸盐的溶液，分 装试管，每管2mL。挑取30°C温培养的18~24h的菌落至2mL的葡萄糖酸盐溶液中制 成浓的菌悬液，置30°C过夜。每管加入0.5mL的斐林试剂，放在沸水浴中加热10分钟, 观察结果。试管中液体由蓝色变为黄绿，绿橙色或出现红色沉淀者为阳性反应，如溶液 不变色者为阴性。

(16)耐盐性试验：以肉汤培养液根据鉴定需要，配成不同浓度的NaCl，如2%、3.5%、 5%、7%、10%等。培养基要求十分澄清，接种时应采用幼龄菌液，直针接种，适温培 养3〜7d，与未接种的对照管对比，目测生长情况。

(17)酪素水解试验（酪蛋白水解)：取5g脱脂奶粉加入50mL蒸馏水中，称1.5g琼脂 溶于50mL蒸馏水中，将两液分开灭菌。稍冷却后将两液混匀倒平板，即成牛奶平板。 将平板倒置过夜后将菌种点接在平板上。适温培养1、3、5天，观察结果，记录菌落周

围和下面酪素是否已被分解而呈透明。

(18)苯丙氨酸脱氨试验：将菌种接种于该培养基斜面上，30°C下温培养3〜7d。取10% 的FeCl3水溶液4滴，滴加在生长菌苔的斜面上，当斜面和试剂液面处呈蓝绿色时则为 阳性反应。

(19)产糊精结晶试验：在大试管中装碾过的小麦0.5g，碳酸钙0.2g, H20 10mL,灭 菌后接种，35°C培养3d、5d和7d后，取1滴卢哥尔氏捵液混匀，干燥后，用显微镜观 察有暗褐色或蓝色的六角形结晶的糊精，假若大量形成，则排列为扇形或针状。

(20)在pH5.7营养肉汤上的生长：取菌液一环，接种于上述培养基中，同时接种普通 肉汤液（7.2pH)作对照。适温培养1〜3d后观察生长情况。

(21)需氧性试验：用接种环挑取一环肉汤菌液，穿刺接种到基础培养基中，30°C培养， 在3至7天观察结果。如细菌在琼脂柱表面上生长者为好氧菌，如沿着穿刺线上生长者 为厌氧菌或兼性厌氧菌。

(22)淀粉水解试验：待测菌种培养18〜24h得到纯培养物，涂布接种于淀粉琼脂平板， 于36°C培养24~48h，然后将碘试剂直接滴浸于培养表面，立即检视结果，阳性反应时 淀粉被分解，琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培养物周围出现无色透明环、或肉汤颜色无 变化。阴性反应则无透明环或肉汤呈深蓝色。

(23)生长温度的测定：放置于恒温水浴培养。聚合物降解菌的分离筛选及鉴定，指示温度计应放在同样的试管和培养基 内，在指定温度下培养2〜5d，观察生长情况。在接近0°C的低温培养，则观察时间可延 长至7~10山甚至30d#目测生长情况，与未接种的空白培养基对比，注意混浊度、沉 淀物和悬浮物等项。

(24)形成芽孢的培养基形成芽孢是芽孢杆菌的关键性特征，但不是所有的芽孢杆菌都 能在任何条件下形成芽孢。在鉴定细菌时，为了确定是否属芽孢菌，需要对那些在一般 条件下不形成芽孢的细菌，采用生孢子培养基，来确定是否能形成芽孢。

3实验结果及讨论

3.1菌株的分离筛选形态鉴定结果

经过富集培养基富集，对目标菌株进行分离、纯化，共得到2株具有降解HPAM潜 能的菌株。

陕西长庆43-1号油田泥浆池废液中分离的菌种如图1所示，命名为CJ419。革兰氏 染色为阴性，菌株细胞呈小杆状，可运动；在牛肉膏蛋白胨培养基上为乳白色菌落，光 滑。

4*23号油田泥浆池废液中富集分离的菌种如图2所示，命名为FA16。革兰氏染色为 阳性，菌体为短杆状，在牛肉膏蛋白胨培养基上为白色菌落，菌落不规则生长、表面有

褶皱.

3. 2面株的生理生化性质鉴定结果

依据《Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology》和 < 常见细菌系统鉴定手册》, 对菌株CJ419和FA16的分别进行吲哚试验、接触酶反应等生理生化特征鉴定，结果见 表24。

表24拮抗菌株CJ419和FA16生理生化特征 Table 2-4 Antagonistic strains CJ419 and FA16 physiological and biochemical characteristics

项目菌株CJ419项目菌株FA16

严格好氧+鞭毛数>1

过氧化氢酶+荧光色素-

硝酸盐还原+在4。<：生长+

淀粉水解+在41°C生长-

吲哚产生-从蔗糖产生果聚糖+

H2S产生-精氨酸双水解酶+

酪素水解+氧化酶反应+

柠檬酸盐利用+反硝化+

pH5.7营养肉汤+明胶水解+

V.P试验+淀粉水解■

温度45 °C+葡萄糖

利用+

温度65 °C■海藻糖+

葡萄糖产酸+L-脯氨酸+

乳糖产酸6•苯丙氨酸+

甘露醇产酸 葡萄糖产气 10%NaCl+

+DL-精氨酸+

由表2>4可知，菌株FA16的生理生化特征与假单胞菌标准株保持一致。通过查阅 《Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology》和《常见细菌系统鉴定手册》，聚合物降解菌的分离筛选及鉴定，综合菌 株形态特征和生理生化特征，可初步确定菌株属于假单胞菌

菌株CJ419的生理生化特征与枯草芽孢杆菌标准菌株保持一致。综合菌株形态特征 和生理生化特征，通过查阅相关鉴定手册，可初步确定菌株属于芽孢杆菌(Bacillus spp.)。

4小结

(1)从聚合物含量很高的陕西长庆43-1号油田泥浆池废液和4-23号油田废弃泥浆 池周围土壤中采样，将所采集的HPAM污染土样富集培养基，连续传代得到富集的 HPAM降解混合菌。取菌液涂布于以HPAM为唯一碳源的筛选养基上，选择生长良好 的性状差异明显的菌落，连续平板划线纯化，通过对样品的筛选得到对聚丙烯酰胺有高 度适应能力和降解能力的两株菌株，分别命名为CJ419和FA16。

(2)对两菌株进行宏观形态和显微鉴定、生理生化鉴定，依据《Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology》和《常见细菌系统鉴定手册》，最终初步确定CJ419为假单 胞菌FA16 为枯草芽孢杆菌 。

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