腈水合酶是一类可以催化腈类物质转化成相 应酰胺类物质的酶，主要应用于催化水合丙烯腈生产丙烯丑胺。丙烯酰胺是一种用途广泛的精细 化工产品，主要用于制造均聚物或共聚物，广泛应 用于石油开采、造纸、废水处理、冶金、食品和化工 等领域：3’4]。微生物法生产丙烯酰胺的技术关键在 于保证微生物转化过程中腈水合酶的高效性和稳 定性，采用游离酶或微生物生产丙烯酰胺具有一定 的不稳定性，在热、酸、碱及有机溶剂存在的条件 下，腈水合酶的活性极易降低甚至丧失；而采用微 生物固定化技术能有效提高腈水合酶的稳定性并 可反复使用，具有一定的优越性。
腈水合酶产生菌株的固定化在我国一般采用海藻酸钠包埋法，在日本主要采用聚丙烯酰胺 (PAM)凝胶包埋法[5]。利用海藻酸盐固定化微生 物具有制备方法简单、酶活力损失少、生物毒性小 等优点，但其机械强度较低，而且在含有多价阴离 子以及高浓度电解质的溶液中不稳定，特别是在磷 酸盐体系中，固定化细胞易破碎;6’7]。PAM固定化 法的优点是化学性能稳定、机械强度高，缺点是固 定化细胞成型性和可控性不佳?。
本工作采用海藻酸钠（SA)和PAM两种固定 化载体对腈水合酶产生菌株进行固定化，优化了固 定化条件，以期获得更适宜于腈水合酶产生菌株的 固定化载体并提高腈水合酶的稳定性。
1实验部分1.1菌种腈水合酶产生菌株灿sp. HUST -3 由哈尔滨理工大学微生物实验室分离筛选并保藏。 1.2固定化细胞的制备1.2.1PAM固定化法将一定量的腈水合酶产生菌细胞、丙烯酰胺、 交联剂-甲叉双丙烯酰胺（BIS)和水配成混 合液，搅拌下滴入2 mL引发剂过硫酸铵和1 ~2滴 催化剂四甲基乙二胺，在冰水浴中静置聚合成凝胶 状。在4 t下固定化6 h后将凝胶用手术刀切成 3 mm3的立方体胶粒，用蒸馏水反复洗涤后滤干，即 得PAM固定化细胞颗粒。
1.2.2SA-PAM联合固定化法分别将质量分数3. 5%的SA溶液与不同质量 分数的PAM溶液、质量浓度1 g/L的腈水合酶菌悬 液(简称菌悬液）按体积比20: 1“=0.5,1.0,1.5,2.0,3.0,4.0,5.0)混合均匀，用医用注射器将 上述混合液平稳滴人到质量分数4%的CaCl2溶液 中形成小球;在4 t下固定化6 h，滤出小球，用蒸馏 水反复洗涤后置于不同质量分数的交联剂戊二醛 溶液中交联20 min,即得SA - PAM固定化细胞 小球。
1.3酶活力的测定游离态细胞酶活力的测定：按GB 12005.3—89 《聚丙烯酰胺中残留丙烯酰胺含量测定方法——溴 化法》测定。本实验所使用的游离态细胞的酶活力为 1 305.64 U。
固定化细胞酶活力的测定：与游离态细胞酶活 力的测定方法相同，只是将反应体系的体积扩大为 原体积的5倍，菌悬液体积为包含相同生物量的固 定化细胞小球体积。
相对酶活：相同菌悬液浓度的固定化细胞酶活 力与游离态细胞酶活力的比值。
1.4固定化细胞机械强度的测定挑选100个大小均匀的固定化细胞颗粒，放于 500 mL 烧杯中，加水 100 mL,以 500 ~ 3 000 r/min 的搅拌转速搅拌5 min,观察颗粒的直径变化和破 损情况。机械强度为未破损颗粒个数与总颗粒个 数的比值。
2结果与讨论2.1 PAM固定化法2.1.1细胞加入量对相对酶活的影响细胞加入量对相对酶活的影响见图1。从图1 可看出，随细胞加人量的增大，相对酶活先提高后 降低，当细胞加人量为5 g/L时，相对酶活最高，达 48. 8%;继续增大细胞加人量则相对酶活降低。因 此，最佳细胞加人量为5 g/L。
2.1.2丙烯酰胺加入量对相对酶活的影响丙烯酰胺加入量对相对酶活的影响见图2。由 图2可知，随丙稀酰胺加入量的增大，相对酶活先提 高后降低，当丙烯酰胺加入量为180 g/L时，相对酶 活最高，达56.7% ;继续增大丙烯酰胺加人量则相对 酶活降低。因而，最佳丙烯酰胺加人量为180 g/L。
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2010年第39卷2.1.3BIS加入量的影响BIS加人量对相对酶活和固定化细胞机械强度 的影响见表1。从表1可知，BIS加入量对固定化细 胞的机械强度影响较大而对相对酶活影响较小，当 BIS加入量小于7 g/L时，随BIS加人量的增加，固 定化细胞的机械强度迅速增大而相对酶活小幅度 提高；当BIS加入量大于7 g/L时，随BIS加人量的 增加，固定化细胞的机械强度保持最高而相对酶活 开始降低。因此最佳BIS加人量为7 g/L，此时固 定化细胞的机械强度和相对酶活最髙，分别为90% 和 60.7%。
表1 BIS加入量对相对酶活和固定化细胞机械强度的影响 Table 1 Effect of BIS dosage on relative enzyme activity and mechanical strength of the immobilization cellBIS dosage/ (g * L "1) E{/E,% Mechanical strength,%355.130457.450557.150659.670760.790858.390957.2901054.690Immobolization conditions： AM dosage 60 g/L, cell dosage5g/L, 4 t：？6h.
Reaction conditions referred to Fig. 1.
2.2 SA-PAM联合固定化法PAM具有增稠作用与静电吸附效应，与SA制 成复合载体可以增强凝胶强度，减少细胞流失，并 且提高固定化细胞的稳定性。
2.2.1PAM溶液质量分数对相对酶活的影响 PAM溶液质量分数对相对酶活的影响见图3。
由图3可看出，随PAM溶液质量分数的增大，相对 酶活先提高后降低，当PAM溶液质量分数达到6% 时，相对酶活最高，为82.3%。同时在实验过程中发 现，当PAM溶液质量分数低于4%时，固定化细胞的 机械强度较差，反应过程中细胞容易溶解;当PAM溶 液质量分数超过6%时，溶液过于黏稠，制成的固定 化小球有脱尾现象;当PAM溶液质量分数为4% ~ 6%时，固定化细胞的成型性最好。故最佳PAM溶 液质量分数为6%。
2.2.2PAM溶液与菌悬液体积比对相对酶活的 影响PAM溶液与菌悬液体积比对相对酶活的影响 见图4。从图4可见，当PAM溶液与菌悬液的体 积比为1.5 : 1时相对酶活最高。已知SA与菌悬 液的最优体积比为20 : 1，因此在SA - PAM联合 固定化法中，SA溶液、PAM溶液与菌悬液的最佳 体积比为20 : 1. 5 : 1，此时相对酶活最高，为 85. 2% 02.2.3戊二醛溶液体积分数对相对酶活的影响 交联剂戊二醛能使酶蛋白分子间产生交联作 用，凝集成网状结构，从而提高固定化酶的酶活力 和强度~ ;同时戊二醛又是一种酶变性剂，经它处 理过的固定化细胞的酶活力损失较大，因此考察了 戊二醛溶液体积分数对相对酶活的影响，实验结果 见图5。
由图5可看出，随戊二醛溶液体积分数的增加， 相对酶活逐渐提高，这说明戊二醛的交联作用起主 导作用。当戊二醛体积分数大于2%时，相对酶活 大幅度下降，这证明戊二醛是一种酶变性剂，用量 过多会导致细胞失活。同时在实验过程中发现，经 戊二醛交联后细胞的机械强度明显增强，因此确定 戊二醛的最佳体积分数为2%，此时相对酶活最高， 为 92.1%。
2.3SA-PAM联合固定化细胞的重复使用次数 对相对酶活的影响SA - PAM联合固定化细胞的重复使用次数对 相对酶活的影响见表2。由表2可见，SA-PAM联 合固定化细胞在重复使用9次后，相对酶活仍保持 在50%以上，而PAM固定化细胞只能进行1次反 应。由此可见，SA-PAM联合固定化细胞具有更 高的操作稳定性。 表2 SA - PAM联合固定化细胞的重复使用次数对相对酶活的影响Table 2 Effect of reuse times of SA-PAM co-immobilization cells on relative enzyme activityReuse timesEx/E,%Reuse timesReuse times E^E,%192.7477.6762.4286.7568.3857.9379.5664.3950.1Immobolization conditions； p(cell) =1 g/Lf vv(SA) =3.5%, w(PAM) =6%, V(SA) ： K(PAM) ： V (ceU) = 20 ： 1. 5 ： 1, <p( glutaraldehyde) =2% , 4 t, 6 h.
Reaction conditions referred to Fig. 1,3结论(1)PAM固定化法的最佳条件为：细胞加入量 5 g/L、丙烯酰胺加入量180 g/L、BIS加人量7 g/L、 4 t下固定化6 h,此时相对酶活最高（为60.7%); SA -PAM联合固定化法的最佳条件为：SA溶液质 量分数3.5%,菌悬液质量浓度1§/1^？八\1溶液质 量分数6%，SA溶液、PAM溶液与菌悬液的体积比 20 : 1.5 : 1，交联剂戊二醛的体积分数2%,4 t下 固定化6 h,此时相对酶活最高（为92. 7%)。相同 反应条件下，SA-PAM联合固定化细胞的相对酶 活高于PAM固定化法。
(2)SA-PAM联合固定化细胞在重复使用9 次时，相对酶活仍为50. 1%，说明SA -PAM联合 固定化的腈水合酶具有较高的稳定性。