微卫星序列又称简单序列重复(Simple sequ?ence repeat, SSR) ， 是广泛分布于真核生物基因组 中的高度重复序列。在动植物研究方面，目前己成 为遗传连锁分析、基因定位以及遗传标记图谱构建 等领域一个极为重要的研究手段[1，2]。典型的微卫星 DNA重复单位的核心序列为2~6 bp，重复次数为 10~20 次，长度一般为 100~300 bp。
聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide gel elec?trophoresis, PAGE) 技术由于其检测灵敏和分辨率高 的特点，特别适合于小片段多态性扩増产物条带的检测，并且分离效果好，分辨率高。理论上，不同浓度马铃薯的凝胶在一定范围内，凝胶的浓度越大，分辨 率越高，对长度差异片段区分性越好，越有利于基 因型的判断。扩増片段检测目前主要采用溴化乙锭 (Ethidium bromide, EB)染色与硝酸银染色[3]。银染 由于染色背景较深，非特异性条带较多，品种之间 的特异性条带不易区分，不利于进行品种纯度方面 的鉴定分析[4];聚丙烯酰胺淬灭EB的荧光，使EB 染色的灵敏度降低，但是此方法操作时间短、程序 简单、背景颜色浅、成像容易，使得SSR扩増的 多态性目的条带带型清晰，数量也能够满足实验分 析要求。另外，EB染色结果具有一致性，重复性 好的优点，成为品种鉴定方法中条带染色的首选方 法。
本试验拟通过对聚丙烯酰胺凝胶电泳参数的分 析，确立马铃薯品种纯度鉴定中标记产物的最佳电 泳体系，以满足试验分析的需要，同时为马铃薯主 栽品种DNA指纹图谱的构建打下理论基础。
1材料与方法1.1试验材料本试验选用的马铃薯为黑龙江省主栽品种，由 黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所提供(表 1)。
SSR标记所用引物序列由加拿大蒙特利尔麦吉 大学科研组提供(表2)，并由上海生工生物技术公 司合成；其它试剂(TaqDNA聚合酶等)均购自大连 宝生物试剂公司。
表1试验用马铃薯品种序号品种名称级别1早大白原原种2黄麻子原原种3克新13号原原种4荷兰15原原种5大西洋原原种表2 SSR标记所用引物序列情况引物编号序列顺序^到30SSI-FTCT CTT GAC ACG TGT CAC TGA AACSSI-RTCA CCG ATT ACA GTA GGC AAG AGAPatatin-FCAA CCA ACA AGG TAA ATG GTA CCPatatin-RTGG TCT GGT GCA TTA GAA AAA ASTM0014-FCAG TCT TCA GCC CAT AGGSTM0014-RTAA ACA ATG GTA GAC AAG ACA AAUGP-FGAA ACT GCT GCC GGT GCUGP-RTGG GGT TCC ATC AAA C电泳操作如上，比较不同电压电泳结果的差异。
表3不同浓度聚丙烯酰胺凝胶的配制凝胶浓度5%8%12%16%30%丙烯酰胺储液(ml)1.662.6645.25 X TBE (mD222210%过硫酸胺（APS) ([xL100100100100四甲基乙二胺(TEMED) (pH10101010双蒸水(mL6.845.8442.8分离的DNA大小(bp)80~50060~40040~20020~1001.2试验方法1.2.1马铃薯块茎DNA提取米用Isolation buffer提取液提取马铃薯DNA， Isolation buffer 提取液配方如下：100 mM Tris (pH 8.0)，50 mM EDTA (pH 8.0)，1.3 M NaCl， 0.2%SDS，0.5% Triton X-100, 1% PVP， 10 mM DTT，60 mM b-mercapto ethanol，其它操作步骤同 一般SDS提取方法[5,6]，并用Alpha Innotech公司的 December 2006型紫外凝胶成像仪检测结果。
1.2.2SSR 标记PCR反应体系(20 |xL):10xPCR 缓冲液 2 |xL，10 mM dNTPs 0.8 |xL， 25 mM MgCl2 2.4 |xL，Taq DNA 聚合酶(5 U /|xL) 0.15 ^L，4mM上游引物1 ^L，4mM下游引物1 |xL，灭菌双蒸水11.65|xL，模板DNA60ng。
PCR扩増程序：95T：预变性 5 min; 94T：变性 30 s，48.5T：复 性45 s，72T：延伸90 s，共35个循环；72T：延伸 7 min，在 Biometre 公司 T-Gradient Thermoblock 型号PCR扩増仪上扩増，产物4丈保存。
PCR产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，EB染 色，紫外凝胶成像仪检测结果。
1.2.3聚丙烯酰胺凝胶电泳参数分析(1)不同浓度的聚丙烯酰胺凝胶电泳比较分别配制5%、8%、12%、16%的聚丙烯酰 胺凝胶，所需各种试剂及用量如表3，预电泳 30 min 后，取 PCR 产物 5|xL 与 1|xL 6-Loading Buffer混匀，上样，电泳，EB染色，紫外凝胶成 像仪检测结果。
(2)电压变化对电泳结果的影响设置电压梯度为330V、250V、170V、90V，(3)凝胶染色方法比较①银染方法：A.银染液的配制：固定液（100 mL冰乙酸加水 稀释至 1 000 mL);染色液（2g AgNO3、1.5 mL 37%甲醛，加水稀释至1 000 mL ;显色液（30 g Na2CO3、1.5 mL 37% 甲醛、0.2 mL Na2S2O3，加水 稀释至1 000 mL ;终止液（10%冰乙酸。
B银染法操作：固定30min—去离子水洗涤5~ 10 min—?染色30 min—?去离子水洗潘2次（每次不 超过30 s)—显色至所要程度^终止显影。
②溴化乙锭(EB)染色：将EB贮液（10 mg ‘mL-)用双蒸水稀释至 0.5 ^g’mL-1，将电泳后的凝胶放入染色液中30 min，染色后的凝胶放入蒸馈水中清洗5 min，再 将凝胶放入紫外凝胶成像仪观测结果。
2结果与分析2.1 DNA提取结果将5个马铃薯品种提取的DNA，各取5 ^L， 与16-Loading Buffer混匀，用1%琼脂糖凝胶，100 V电压，电泳30 min，结果用紫外凝胶成像仪 检测。从电泳结果可以看出，用Isolation buffer提 取液提取的马铃薯DNA，质量好，主带唯一，无 拖尾和弥散，能够满足SSR标记的要求（图11。
2.2不同参数电泳结果比较2.2.1不同浓度的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果不同浓度的聚丙烯酰胺凝胶，凝胶的孔径大 小、分辨率不同，分离效果也明显不一样（图2)。 凝胶浓度较低时一5%，胶的分辨率明显不好，SSR 标记扩増的多态性条带数量少，带型模糊，不利于 带型区分、品种区分；12%和8%浓度的凝胶相比， 多态性条带数量多，带型清晰，品种之间的区分更 明显；16%浓度的凝胶电泳，多态性条带数量并没 有较12%浓度的凝胶有明显的増加，并且由于电泳 时间过长，单一条带反而有些离散，不如12%浓 度的凝胶条带集中、明亮，同时配制16%浓度的 凝胶所需要的相关试验试剂的用量也比较大，试验 成本也会相应増加。
3—12%浓度的 PAGE; 4—16%浓度的 PAGE。
(泳道对应的马铃薯品种顺序与表1对应，M为标准分子质量2.2.2不同电压下的电泳结果在实际电泳操作中，不同电压下的电泳对应的 时间、电流参数如表4。
表4不同实际操作电压下的时间、电流参数值电压（V)工作参数电流(mA)时间(min)
330928025057150170462609026460在330V电压下，电泳只需要80 min就能完 成，但是因为电泳速度过快，标记的多态性条带不能完全分离开来，并且条带不清悉；90 V电压下， 电泳结果比较好，能够满足实验分析的需要，但是 电泳时间太长，接近8个小时；250 V、170 V电 压均能将泳道中的多态性条带分开，满足试验分析 的需要，并且，170 V电压电泳，多态性条带更清 晰，可以采用（图3)。
2.2.3PCR标记产物不同染色方法的结果比较 EB染色，多态性条带清晰，背景浅，并且同 一品种多次扩増成像一致，便于实验结果分析；银 染法随着时间的増长，背景逐渐加深，显示的多态 性条带数目増多，目的条带相近的细小条带(俗称 影子带）也在増多，若对目的条带带型不是很了 解，则不利于基因型的判断，对多态性信息量、简 单匹配系数等的试验分析也容易出现错误。比较结 果如图4。
1001234图3不同电压下的电泳结果1 一电压为330 V; 2 —电压为250 V;3—电压为170V; 4—电压为90V。
(泳道对应的马铃薯品种顺序与表1对应，M为标准分子质量12 3 45M12345M12345M12345M12345M1000100010001 1500 爸；;500500- 500- 500P 500400— 400—400—400^400300— 300—300-300"300■ _ _ _ ■图4SSR标记产物不同染色方法结果比较1—标记产物EB染色结果；2—银染20 min结果；3—银染30 min结果；4—银染50 min结果；5—银染70 min结果。
(泳道马铃薯品种顺序与表1相同，M为标准分子质量3结果与讨论SSR标记与其它标记方法（RFLP、RAPD、 AFLP等)相比，具有共显性遗传，符合孟德尔遗传 规律，数量丰富，分布均匀，覆盖整个基因组， 试验重复性好，结果可靠性高等优点[7,8]，是马铃 薯品种纯度鉴定分析的理想的分子标记。SSR标记 结合聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的检测方法， 聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨力极高，用于测序的聚 丙烯酰胺凝胶可分离相差1 bp的DNA片段，能 够将品种特异性的谱带分离出来，进而判定纯度 和真实性。但是对凝胶结果影响因素较多，不同 的试验处理对成像结果都有影响，影响大的以至 于不能进行试验结果的分析，因此，需要对聚丙 烯酰胺凝胶电泳参数进行优化，聚丙烯酰胺凝胶的 浓度、电泳时间都是其中重要的参数，试验结果表 明：在聚丙烯酰胺凝胶的浓度为12%、电泳电压 为170V的情况下，PCR标记产物多态性条带清晰、 明亮、稳定，便于试验分析与交流。PCR扩増产 物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，目标产物的检测 主要采取显色法。目前大多采用同位素放射自显影 法、荧光染料标记法、EB染色法和银染法，放射 自显影法操作过程比较繁琐，且操作者容易遭受同 位素照射的危险，在推广应用中有一定的难度；荧 光染料标记法操作过程同样繁琐，试验成本较高； 银染法其检测的灵敏度接近于同位素检测，但是整 个银染检测操作步骤也非常繁锁，染色花费的时间 也较长(染色1次约需要2 h)，同时，使用到的配 制试剂较多，试验稳定性也难以控制，不利于品种 鉴定[9]; EB染色法方便易行，时间短，全程只需要 35 min操作比较简单，只需要配置一种溶液，采 用两个步骤，紫外凝胶成像仪成像方便，并且EB 染色结果稳定，利于试验分析。但是EB具有致癌 性，对人身体健康有害，因此，找到一种更好的染 色方法，既有利于试验分析，又不危害身体，对 SSR标记方面的研究是非常必要的。