近年来，以重组DNA和单克隆抗体技术生产的蛋白质、多肽、酶、激素、疫苗、抗体和 细胞生长因子等生物技术药物，成为了荧光漂白恢复技术越来越热门的研究对象总体上它们具有几个 共同的特点[2]:第一，分子量较大，热稳定性差，易被蛋白质水解酶水解;第二，生物利用 度不高，具有较强的亲水性，不易通过生物屏障;第三，具有特定的维结构，任何改变其 结构的化学物质和环境都会对生物活性造成很大的影响。生物大分子药物透皮给药技术 的发展，使蛋白类药物能够避免胃肠道的酶解和肝脏的首过效应，提高药物的生物利用 度。与此同时，兼顾蛋白质类药物稳定性的药物载体的研究，也已经成为人们所关注的焦点。

现今比较常用的一种药物载体是水凝胶，它广泛应用于生物制药等领域M.具有互 相贯穿的网络结构的水凝胶能够吸取大量的水形成稳定三维结构，蛋白质分子在水凝胶 中亲水基团的帮助下，有助于保持其生物结构和活性?卡波姆(carb〇mer)就是其中一种 已经商品化的水凝胶[4]，根据材料和聚合度的不同可以分为两个系列：卡波姆9〇〇系列， 由丙烯酸单聚物与烯丙基蔗糖或烯丙基季戊四醇交联;卡波姆1300系列，为丙烯酸烷基 异丁烯酸共聚物与烯丙基季戊四醇交联?卡波姆具有高稳定性、生物相容性以及低毒性 的优点，但是作为透皮给药制剂的载体，具有与皮肤的粘附性差，药物释放可控度低的缺 点。因此为了开发蛋白类药物的透皮给药制剂，首先需要研究合适的药物载体。这种药物 载体在具有优良生物相容性、皮肤粘附性特点的同时，还应具有良好的药物释放可控性。 为了能够直观地研究蛋白类药物在载体中的扩散规律，激光扫描共聚焦显微镜实时成像 技术与突光漂白恢复（fluorescence recovery after photobleaching，FRAP)技术1"5]相结合， 被用来开展蛋白药物在凝胶载体中扩散系数的研究。主要原理是借助高强度脉冲式激光 照射凝胶中的某一区域，从而造成该区域被荧光标记的蛋白发生荧光漂白。然后通过低 强度激光扫描，记录该区域周围未漂白的荧光标记的蛋白向被照射区域扩散的速度M. 在本文中，我们合成了低分子量的不同单体配比的系列聚丙烯丑胺-丙稀酸（p(Am-co~ Ac))作为水凝胶药物载体，应用红外光谱表征其结构特性?以FITC标记的牛血清白蛋 白（BSA)作为药物模型分子，通过FRAP实验，考察FITC-BSA在P(Am-co~Ac)共聚物 凝胶中的扩散行为。通过这些研究，揭示了不同单体配比的P(Am-C〇"Ac)水凝胶对BSA 蛋白扩散的影响，为蛋白质凝胶载体的进一步深入研究提供了科学依据。

 

1实验部分1.1仪器与试剂仪器：EASYPure LF超纯水制取设备（美国Barnsted公司）；Excalibur HE 3100傅 立叶变换红外光谱仪(美国Varian公司）;Nikon Cl si全光谱激光扫描共聚焦显微镜（日 本Nikon公司).

 

试剂：异硫氰酸荧光素(FITC)(北京成文免疫化学研究室）；牛血清白蛋白（RSA)标 准品（中国药品生物制品鉴定所）；丙烯酰胺（Am)(电化学纯度，Acros公司）；丙烯酸 (Ac)(电泳纯度，Acros公司，使用前进行纯化）；N, N-甲叉双丙烯酰胺(BIS)(分析纯， agma-Aldrich公司）;偶氮二异丁腈(MBAm)(分析纯，北京化工试剂厂）；氯化钠、氯化 钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠均为分析纯试剂，所有实验用水均为超纯水。

 

1.2交联聚丙烯酰胺-丙烯酸共聚物的制备将丙烯丑胺和N，N-甲叉双丙烯酰胺(BIS)加入圆底烧瓶中，然后加入30 mL丙酮 使其完全溶解。通人氮气10 min驱除溶解在溶液中的氧气?室温下加入〇。 5%(质量分 数)的引发剂偶氮二异丁腈(MBAm)，继续通入氮气10 min后，逐滴滴加丙烯酸溶液。缓 慢升温至65 °C，反应10 min后，出现白色沉淀。反应持续3 h，停止反应，可观察到明显 的白色浑浊溶液。反应完毕后，按100 mL/g的比例，用无水乙醇溶解初产物，搅拌1〇

 

min后抽滤。重复洗涤抽滤5次后，得到白色固体粉末?置于60 X：烘箱中6 h，即得到干 燥的白色粉末。根据单体配比的不同，共制备得到4种不同组成的共聚物。表1列出了 其单体比例。

 

表1制备聚丙烯酰胺-丙烯酸共聚物中丙烯酰胺和丙烯酸比例及其他试剂条件Polymerization conditions of P(Am-co-Ac)copolymersAcrylamideAcrylic acidBISMBAmAcetone (mL)

 

60%40%5%〇2%〇3070%30%5%〇2%〇3080%20%5%〇2%〇3087.5%12.5%5%〇2%301.3聚丙烯酰胺-丙烯酸共聚物的红外表征将样品与预先干燥好的KBr(分析纯)混合后（样品与KBr质量比为1 : 100)，于玛 瑙研钵中研磨均匀，然后压片制样?采用Varian 3100 FT-IR Excalibur series红外分析 仪，对P(Am-C〇~Ac)进行红外分析。扫描次数为64次，分辨率为2 cm—1，扫描范围为 400-—4000 cm—1,实验温度为 25 °C.

 

1. 4异硫氰酸荧光素标记牛血清白蛋白FITC-BSA的制备按P : F(BSA : FITC) = 8 : 1的比例，将FITC缓缓加入到BSA蛋白溶液中，4 X： 下避光搅拌3 h,经高速离心去除变性蛋白。以Sepheader G~50柱分离，去除游离的 FITC，对FITC标记的BSA分管收集，经分光光度计测定其FITC及BSA蛋白浓度，制 得 FITC-BSA(标记比 Mmr : %脱=1. 75, _ = 15. 12 mg/mL).

 

1.5聚丙烯酰胺-丙烯酸(P(Anw^Ac))凝胶样品制备pH=7. 4 的磷酸盐缓冲液(PBS)配制方法：取 〇。 2044 g KC1，0? 2634 g KH2P04， 8.0044 gNaCl，1.4410gNa2HP〇4 ? 12H20 于 1 L 烧杯中，加入 950 mL 超纯水溶解 后，调节pH至7. 4,然后定容至1.0 L.

 

BSA蛋白凝胶样品制备方法：（1)配制共聚物浓度为1.5 %，FITC-BSA浓度分别为 1 mg/mL, 2 mg/mL，3 mg/mL的水凝胶。（2)将凝胶滴于圆形载玻片上，保证样品厚度 为50 pm?另外，温度会影响FITC-BSA扩散速率的测定，因此室温保持在23 C.

 

1.6应用激光扫描共聚焦显微镜进行荧光漂白恢复(FRAP)测定为了研究FITC-BSA在凝胶分子中的扩散系数，使用氩离子激光器，在光斑模式下 (TEM^Mode)在480 rnn的波长下照射载玻片上的FITC-BSA蛋白凝胶样品?使用20 倍镜头观察样品。在观察的区域内选择直径为2〇 fxm的圆形区域作为漂白范围。使用 100%的激光能源在/ = 〇时刻，将光斑内FITC-BSA迅速漂白。然后再次监测漂白区 FITC-BSA的荧光恢复情况，每隔5 s记录荧光恢复情况图像。另外，实验过程中用于监 测扫描的荧光强度选择在不对样品荧光产生漂白的强度，为激光器能源的28. 2%.

 

1.7荧光漂白恢复(FRAP)数据分析FRAP的数据分析，采用文献中提到的用于研究蛋白质在凝胶中的扩散研究公 式[7].在漂白区域内，蛋白的扩散过程由二维扩散方程表示：c(w，t;，f)=c(M，x)，0)exp[—4；T(M2+T/)Z>](1)

 

其中M和是空间频率?同时，根据Tanke等人先前的研究，焚光蛋白浓度降低所引 起的内部衍射和重吸收可以忽略不计。因此荧光恢复强度则成为时间的一次函数。根据 傅立叶变换，二维扩散方程可变化为：I(u,v,t)=c(.u,v,t)OTF(u,v)(2)

 

其中是某处的荧光强度。再与光学传递函数变换结合则荧光恢复方程为：I / I〇=c/c〇 =exp[—4n2qzDt'](3)

 

其中 7〇= KM,取，0)，c〇 =C(M，T;，0)，M2+为扩散系数。由 J//〇对一47r2g2f的线性模拟可求得扩散系数D.

 

2结果与讨论2.1聚丙烯酰胺丙烯酸共聚物的制备和表征本实验中采用水相聚合的方法制备聚丙烯酰胺-丙烯酸共聚物[8]，其目的在于控制聚 合物的分子量?根据文献中的报道[9]，采用沉淀聚合的方法，可以得到分子量较低的共聚 物?因为在沉淀聚合过程中所使用的有机溶剂丙酮对丙烯酰胺的聚合是很活泼的链转移 剂，且当聚合物的分子链增长到一定长度后便会沉淀下来，因而限制了分子链的进一步 增长，故所得产物分子量较低[1°].利用该方法合成的聚合物具有溶胀快、粘附性良好的 优点?反应结束后，以乙醇洗涤、抽滤，并以HPLC检验滤液中丙烯酰胺(Am)单体的含 量?直至滤液中存在的单体含量小于0.1/xg/mL?为了确定共聚物的组成，我们采用红 外光谱对聚合物进行分析[11].

 

图1交联聚合物P(Am~co>Ac)的红外谱图 The FTIR of P(Am-co-Ac) with different [Am]/[Ac] ratios图1为P(Am-c〇"Ac)聚合物的红外谱图。在图1 PAAM的红外谱图中，3345 cm-1 处为丙烯酰胺的一NH2的伸缩振动，3190 cm-1处为酰胺I带吸收峰，1663 cm—1为羰基伸 缩振动峰，而1613 cm—1处为一NH2的变形振动，这些吸收峰证实了聚丙烯酰胺的特征结 构?而随体系中丙烯酸含量从〇%逐渐增加到30%时，一NH2的特征吸收峰强度逐渐减 弱，这说明聚合物中丙烯酰胺单体逐渐减少?由于聚合物中丙烯酰胺单体的吸收峰很强， 遮盖了位于1718 cm—1处的丙烯酸(一COOH)特征吸收峰。当丙烯酸含量从30%增加到 40%的时候，位于1718 cm—1处的丙烯酸特征峰强度逐渐增强和1613 cnT1处一NH2吸收 峰的减弱，证实了聚合物中单体的含量改变。在丙烯酸含量为30%、4〇%的聚合物红外 谱图中，可以明显看到兼有丙烯酰胺和丙稀酸特征的吸收峰。

 

2.2F1TC-BSA浓度对于荧光漂白及恢复的影响FRAP技术是一种基于分子自由扩散的荧光检测方法。它是一种应用于细胞内荧光 检测的方法，直到1991年Tsay和Jacobson将FRAP引入到凝胶内分子扩散的研究后， 逐渐成为研究凝胶中分子扩散的最直接、最有效的研究方法L12]?本实验中选用的牛血清 白蛋白，是一种比较成熟的蛋白模型，常作为模型药物用于蛋白制剂的研究?通过激光扫 描共聚焦显微镜，观察荧光漂白后FITC-BSA在凝胶中的扩散情况，以便能定性观察并 且定量地计算FTTC-BSA在凝胶中的扩散系数。实验中，我们首先考察FTTC-BSA浓度 对于荧光漂白恢复(FRAP)实验的影响?在480 nm波长处采用不同的激发强度扫描并记 录图片，然后采用100%的激光强度对选定的圆形范围内进行荧光漂白，再使用与漂白前 相同激光强度观察并记录漂白区域内的荧光恢复情况（每隔5 s进行一次拍照)?实验表 明，FITC-BSA浓度为2 mg/mL和3 mg/mL的水凝胶荧光成像清晰，但漂白效果较差， 漂白区域与非漂白区域对比度低。相比之下，1 mg/mL的FITC-BSA,其漂白和成像效果 均较好，能够得到直观的漂白恢复过程，因此选择FITC>BSA的浓度为111^/"^.

 

2.31 mg/mL FITC-BSA荧光漂白恢复的计算结果为了减少FRAP仪器本身带来的误差和保证检验方法的稳定性，定量测定之前，必 须对荧光恢复的可信度进行验证，然后再对不同丙烯酸含量共聚物的蛋白质扩散进行定 量分析。因此，首先使用1 mg/mL的FITC-BSA水溶液进行荧光漂白恢复实验，实验结 果利用公式(3)计算，1 mg/mL的FITC-BSA扩散系数为6. 8( 土 0. 4) X 10一7 Cm2/S.根 据文献中的报道[7]，在23 °C时FITC和BSA的扩散系数如下：DFrrc = 26( 士 4)X 10_7 cm2/s，DBSA = 6.〇 (土 4)Xl(T7cm2/s.因此实验结果表明本研究中建立的荧光漂白恢 复方法和设备测量得到的数据较为可信。表2总结了在不同丙烯酰胺和丙烯酸比例的 P(Arn-caAc)共聚物中FITC-BSA的扩散系数?图2为FRAP实验中FITC-BSA在表2 FRAP技术测定P(An?〇"Ac)共聚物中FITC-BSA的扩散系数The diffusion coefficients of FITC-BSA in polyacrylamide-co-acrylic acid gelsAqueous12.5%Acrylic acid ratio20%Acrylic acid ratio30%Acrylic acid ratioA〇%Acrylic acid ratioDiffusion coefficient (X10-7 cm"2/s)6.5( 士 l.〇〇>0.52( 士 0? 19)2.1(士 0.51)0.59( 土 0.07)0.47( 士 0.03)

 

1 mg/mL浓度时的荧光恢复情况?结果表明，P(Am-cc^AC)共聚物单体的组成对BSA 蛋白的扩散系数具有显着的影响，丙烯酸含量为20%时蛋白质的扩散系数最大。当丙烯 酸含量从12. 5%增加到20%的时候，蛋白质的扩散系数明显增加?而当丙烯酸含量从图2 FITC-BSA在不同溶液中的荧光漂白前、漂白后和最后恢复的情况 The FITC-BSA in different solutions before bleaching, after bleaching* and recovering respectively (a)—(c):水溶液中FITC-BSA的荧光漂白前、漂白后和最后恢复的情况;(d)—(f): 12.5%丙烯酸含厘的共聚物中; (g)—(i): 20%丙烯酸含量的共聚物中;(j)—(1): 30%丙烯酸含量的共聚物中；（m)—(〇): 40%丙烯酸含量的共聚物中 (a)—(c)： the FITC-BSA in aqueous solution before bleaching, after bleaching, and recovering respectively, (d)—(f)： the FITC-BSA in polymer(12. 5 %)* (g) — (i)： the FITC-BSA in polymer(20//〇),(j)一（1): The FITC-BSA in polymer(30%)，（m)—(n)： The FITC-BSA in polymer(40%)

 

20%增加到30%直至40%的时候，其中蛋白质的扩散系数又明显下降。这说明蛋白质的 扩散系数与其中丙烯酸含量有关。丙烯丑胺与丙烯酸单体比例的差异会导致其三维结构 的差别。蛋白的扩散速度与其交联聚合物的三维结构有关，至于是否与蛋白的电荷有关， 这还需要进一步的研究。

 

3结论通过对FITC-BSA蛋白在聚丙烯酰胺-丙烯酸共聚物中的扩散研究，能够定性并且 定量分析蛋白的荧光漂白恢复(FRAP)情况。从蛋白扩散系数中可以看出：首先，随着丙 烯丑胺和丙烯酸比例的变化，FITC-BSA蛋白在共聚物中的扩散系数产生了明显的变化。 可能是因为交联共聚物的立体网状结构发生了改变，从而影响BSA蛋白的扩散系数；其 次，说明荧光漂白恢复(FRAP)技术确实能够直接而有效地观察蛋白在凝胶制剂中的扩 散情况，从而为体外筛选蛋白药物载体提供了新方法。与传统的体外扩散相比，它具有更 直观、更简便的优点。因此，FRAP技术在凝胶药剂开发这一领域中将具有越来越重要的 应用。最后，FITC-BSA在不同单体比例的聚丙烯酰胺-丙烯酸(P(Am-cc^Ac))共聚物中 的扩散行为不同，表明该共聚物对牛血清白蛋白（BSA)具有优良的释放控制性，具有潜 在的应用价值。