蛋白质、核酸、葡萄糖、氨基酸等许多生物大分子的分离分析是毛细管电泳(CE)应用的重要组成部 分[1]。在蛋白质的毛细管电泳分离中，由于疏水作用 、静电作用及其它因素[3~6]的存在，使得样品在 毛细管内壁上产生吸附，导致严重的峰形拖尾、柱效低、重现性变差等问题，甚至样品滞留在管内不出 峰。解决此问题通常有以下几种方法[3’7]:极端pH值法(缓冲液的pH 8 ~ 11或pH <2);缓冲液中加人 小分子添加剂（如:季铵盐、阳离子表面活性剂、二胺类等）；毛细管内壁的改性，通过物理涂布或化学键 合的方法制备改性柱。前两种方法只能一定程度地减少吸附；pH过高或过低会引起蛋白质变性；添 加剂浓度过大也可导致蛋白质变性；电解质浓度过高还会导致电流增大，对分离效果都会产生负面影 响。因此化学键合改性成为毛细管柱等分离通道处理最常用的方法[8]。此外，电渗流（EOF)的大小及 方向对分离效果影响较大，需要选择合适的电渗流[9]。
本研究采用化学键合法制备改性柱以减轻蛋白质的吸附，通过改变酸、碱性单体的组成调节聚合物 的带电状态，从而有效调节电渗流，使之满足分离的需要。
2实验部分
2.1仪器与试剂
DZF 6020恒温干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）； P/ACE MDQ高效毛细管电泳仪(美国Beckman公司），配紫外检测器、P/ACE数据采集工作站。1 mL 微量注射器。
烯丙基胺、乙烯基横酸钠、丙烯酰胺(单体亚甲基双丙烯酰胺（交联剂）、3-甲基丙烯酰氧丙 基三甲氧基硅烷（y-MAPS，98%，山东鹏浩化工）。其它试剂均为分析纯。一次去离子水。毛细管 (75 jun i.d.，河北省永年锐沣色谱器件有限公司）；新鲜鸡蛋。
2.2不同电荷聚丙烯酰胺改性柱的制备
毛细管预处理方法与文献[10]基本相同。取一定长度的毛细管，分别用0.1 mol/L NaOH溶液和 水依次冲洗40 min，注人y-MAPS浸泡40 min，N2吹干，120丈恒温干燥3 h。
取适量单体溶液溶于水，超声至完全溶解。引入毛细管中反应40 min,N2吹干，120 ^恒温过夜。
2.3样品溶液的制备
取鲜鸡蛋蛋清，溶于8倍体积碟酸盐-尿素缓冲液(pH 5.60)中。隣酸盐、尿素浓度均为10 mmol/L, 轻摇至蛋清溶解，过滤,4弋保存备用。
2.4实验方法
缓冲液使用前超声脱气10 min。分离柱每次实验前用水和缓冲液依次冲洗5 ~ 10 min。正极端压 力进样后，施加一定电压并启动数据采集。电渗流标记物为硫脲（100 mmol/L)，溶于相应缓冲液中。
3结果与讨论
3.1不同聚合物改性柱的电渗流
Table 1 Components of monomer solutions
单体 Monomer聚合物质量P〇丨ymer(g)
12345
丙稀醜胺Aery丨amide0.23320.24060.20430.21050.2011
JV , /V-亚平基双丙稀酰胺 JV，iV-Methylene-bis-acrylamide0.08440.08290.05050.08920.0864
过硫酸按 Ammonium persulfate0.54420.42880.29880.56210.5110
乙铺基磺酸納Sodium vinylsu丨fonate0.1691
稀丙基胺Allylamine0.14421.00323.4251
将所用试剂加入20 mL水，配制5份单体溶液(表1)，制备相应的改性毛细管柱,并与空柱进行对比。 表1单体溶液配比
根据单体溶液的组成，聚合物将含有不同酸性和碱性基团。由表i可见,聚合物i中含有磺酸基， 聚合后也带有相同基团，在缓冲溶液中发生电离，使改性柱内壁带永久负电荷;聚合物2不带电，电渗流 源于未覆盖硅羟基的电离;聚合物3 ~5含有氨基，在pH < 10的缓冲溶液中，其对应的改性柱内壁由于氨 基的电离，会(部分)抵消硅羟基形成的负电荷。
图1是电渗流的变化曲线，柱1未进行改性，
>
0.1
0.0
6
柱2~6分别由表1中聚合物1 ~5改性。与柱1 相比，聚合物改性之后电渗流显著降低。含磺酸 基的聚合物涂层柱2中电渗流降约为原来的 36% ;中性聚合物2改性后，电渗流进一步降低， 低于原来的1/4。随着单体溶液中烯丙基胺的浓 度增大（聚合物3 ~5),相应聚合物中氨基密度提 高，导致电渗流较小。烯丙基胺浓度为50 g/L (约1 mol/L,聚合物4)时，电渗流降到7%左右。 进一步增大烯丙基胺的浓度，电渗流变化趋缓。 如果将烯丙基胺的浓度进一步增加到150 g/L (3 mol/L,聚合物5)时，电渗流相对变化<20% (图1，柱6)。
根据上述改性方法，通过调整乙烯基磺酸钠、 烯丙基胺的浓度及比例，即可方便地制备电渗流
0.9
，0.8丨 0_7
' 0.6 £ 0.5 0.4
S〇-3 〇 0.2 2
不同的改性柱，用以适应不同的分离目的，从而可能实现高效、快速的蛋白质分离。
3.2聚合物电荷不同对分离结果的影响
选取3根改性柱（图1柱2, 3和5),其中的聚合物在所用缓冲溶液中带电状态不同，柱2聚合物含 磺酸基，带负电;柱3聚合物不带电;柱5聚合物含氨基，带正电。在一定缓冲溶液中，各种聚合物的电 离状态不同，预计将对电泳实验产生不同影响。
3根柱子分别用于鸡卵清蛋白质的分离。之所以选择鸡卵清蛋白作为样品，是因为其不但方便易 得，而且主要蛋白质成分均有研究报道。结果如图2,与非改性柱（结果未示出）相比，3根柱对蛋
白质吸附均有改善，保证了分离的顺利进行。柱2 电泳图（图2a)显示，聚合物涂层对蛋白质有一定 的吸附，尤其是其中的碱性组分如溶菌酶等，这应该 归结于磺酸基的电离。柱3和5分别由中性、碱性 聚合物改性,电泳图（图2b和2c)峰形对称，表明蛋 白质的吸附被进一步抑制。电泳图2c与2b相比，
迁移时间更短，峰形更加对称,说明碱性聚合物改性 柱抑制蛋白质吸附的效果最佳。
3.3缓冲液pH值对分离结果的影响
根据前述对改性柱分离度的比较,选择碱性聚合 物改性的柱子(柱5)考察缓冲溶液对电泳的影响。
图3是使用不同pH值缓冲溶液得到的电泳 图。与图2c比较可见，在所选实验条件下，中性或 酸性条件下分离度变差，这是由于此时样品组分，尤 其是碱性蛋白质荷正电，产生了静电吸附。pH 5.33 比pH 7.08出峰数目更少。由此可见，适当增加缓 冲液的pH值可改善分离效果。本研究选用 pH 9.0-10.5 之间。
3.4缓冲液浓度对分离结果的影响
选择柱5考察缓冲液浓度对分离的影响，结果如图4 所示。随着缓冲液浓度的增大，分离度明显改善，样品出峰 数增多。当浓度为300 mm〇l/L时，淌度相近的卵清蛋白和 卵球蛋白也得到了分离（图4c)。这是因为高浓度缓冲液 可以更有效地抑制了蛋内质的吸附。从图4还可见，缓冲 液浓度越大，分离时间越长。说明高浓度缓冲溶液同时减 小了电渗流[14’15]，从而延长了组分迁移时间。而缓冲液浓 度过高会产生过大的焦耳热效应，最终会降低分离度及柱 的寿命。本实验中BBS溶液浓度选择200 mmol/L。
本实验采用原位合成聚合物改性毛细管柱的方法。通 过改变聚合物单体的组成来改变毛细管内壁的带电情况和 调节电渗流。结果表明，含有氨基基团的聚丙烯酰胺改性
的毛细管柱，能够抑制蛋白质的吸附，电渗流降低了至少90%，可以用于蛋白质的电泳分离。