凝胶毛细管电泳信号由自行设计的激光诱导荧光检测系统检测[7]，不同的电场强度下，光电倍增 管数据采集频率为50 Hz，采用电动进样，由计算机程序精确控制进样时间和进样电压，从而消除进样 量的偏差(300 V/cm，进样5 s)，毛细管温度由TEC装置进行温控,从进样端直至检测端保持在40尤。 3结果与讨论
3.1迁移率的测置
通过毛细管凝胶电泳分离DNA样品，电泳场强依次为：100、125、150、175、200、225、250、275、300、 325、350和375 V/cin。80 ~587 bp范围内的11个片段，每种电场强度下重复分离3次,计算得到平均 迁移率和标准偏差。测得不同长度片段的迁移速度与电场强度的关系如图1所示，相对平均标准偏差 为3%。粒子在电场中运动，除了受到电场力的作用，还会受到溶剂阻力的作用，一定时间后，两种力作 用就达到平衡。电泳迁移率为：
fL - v/E = q/6irr)r(1)
式中，f和r分别是球形离子的运动速度和有效半径，17是溶剂粘度。
图1中采用4% LPA为筛分介质，可清楚看出电泳速度与电场强度成正比，电泳速度还和DNA片 段长度有关，片段长度越小，电泳速度越快。从公式（1)来看，迁移率与电场强度无关。但在实际溶液 中,离子不可能只有一种，电泳的有效淌度还与离子半径、溶剂化作用、介电常数、溶剂粘度、离子形状、 电荷、PH、离解度等诸因素有关。在实验中，电场强度很大程度上影响着电泳迁移率。图2是由实验数 据得到的不同电场强度下测量迁移率的对数与DNA片段长度(80 ~587 bP)关系曲线图。
针对小分子和低场强;Reptation(爬行）无拉伸 区，针对稍大的分子和较高的场强的情况;Reptation拉伸区，针对更大的分子和更髙电场强度。
3.2.1 Ogstcm区Ogston模型中描述带电大分子通过高聚物网络的迁移行为:认为凝胶可看成是固 定网孔的分布，平均孔径大小依赖于凝胶成分，尤其是聚合物浓度和交联程度。对迁移的球形粒子来 说，理论假设迁移率和筛孔部分的体积成比例，凝胶形成的基质网孔没有大到影响迁移物质的形状，它 的主要作用是作为一种分子筛。在这种条件下，孔隙尺寸认为比DNA分子尺寸大得多。分离过程是在 迁移溶质能够找到一个足够大的孔隙可以利用的基础上完成的。根据这种假设，得到Ogston等式，溶 质在凝胶基质中的电泳迁移率的表达式为：
fi =/t〇exp(-aC(r + J?g)2)(2)
式中抑是溶质在自由溶液(无限稀释溶液）中的电泳淌度,a是比例常数，C是凝胶状聚合物的浓度， r为聚合物股绳厚度，'是迁移粒子(溶质）的半径，假定迁移的DNA分子是理想的弹性球形粒子，则 »iV1/2，/V是DNA分子核苷单元的链长，且假定远大于r，得到：
fi = /i〇exp( - KCN)(3)
这里，X为常量。两边取对数：
lryt = Vo - KCN(4)
从公式(4)可知，迁移率的对数与片段长度W呈线性关系。然而，由图2可见，对于LPA筛分介质，分离 双链DNA样品，电场强度100 ~375 V/cm变化，曲线没有统一的斜率,并不满足公式(4)。与文献[10, 11]中交联聚丙烯酰胺分离单链DNA大分子的情况不同，文献中改变电场强度对DNA短片段（<200 bp)的迁移率基本无影响。而在本实验中，使用LPA筛分介质，在电场强度变化的情况下，短片段迁移 率的对数值虽然很靠近，但并没有重合。说明在本实验条件下,增大电场强度，不但对长片段的迁移率 影响很大，对短片段的迁移率也有较大影响，迁移率会随着场强的增大而明显增大，Ogstons模型失效。
A是依赖于在单个筛孔中的相关DNA长度的比例常数，并假设抑和A都不依赖于电场强度和片 段长度。这个理论主要阐明迁移率和片段长度的倒 数有一个线性关系，用实验结果作迁移率和1/W的 双对数曲线，如图3所示。如果是符合Reptation无 拉伸理论，那么这个区域应该有一个相等的斜率，这 在双链DNA琼脂糖凝胶w中观察到了此现象。而 图3中曲线只是在一段区域内（>300 bP)呈线性，
更重要的是图3缺乏统一的斜率，因此，Reptation无 拉伸区的理论也不能很好地描述实验结果。
a(
N
+ bE2
(6)
3.2.3Reptation拉伸区当DNA分子相对于凝胶 平均筛孔尺寸更大时,通常用Repation拉伸理论来 描述分离过程。这种条件下，分子量太大而不能轻 易通过筛分介质孔隙，分子迂回前进，头部首先通过 筛孔，随着电场强度的增高分子的拉伸程度增大，迁移率对于分子量大小的依赖程度降低，而是更多地 依赖于电场强度["]。式(6)描述迁移率与DNA分子和电场强度的关系：
式中a是迁移率和分子量有关的常量，6是依赖于聚合物网孔大小、电荷以及粒子片段长度的常量。由 图3看出，当£一定时与log(l/A〇并不是线性关系；图4是实验中任一 DNA片段的迁移率与电 场强度的平方的双对数关系曲线，从图4可看出：当/V—定时，迁移率与£2的双对数并不是线性关系， 因此，实验结果也不满足Reptation拉伸理论。
3.3理论的修正
由以上理论分析，必须对原有理论作修正。首先,实验结果如图2中迁移率的斜率随着电场强度的 改变而改变,说明筛分粒子大小和迁移率的关系会随着电场强度而变。假定这种场依赖的〇gst〇n等式 并没有失效，只是由于改变了 DNA的有效大小，假设DNA在迁移方向拉伸，变得细长更容易通过筛孔。 DNA分子的拉伸程度与所加电场强度与真实的DNA分子量大小有关，这种处理方法使实验可以沿用 Ogston理论，而不受小分子和低电场条件的限制。
综上所述，采用可替换的LPA作为筛分介质进行双链DNA毛细管电泳，利用激光诱导荧光检测系 统检测，实验研究得出在不同电场条件下DNA分子的迁移率。用经典的理论模型对实验结果进行分 析，发现已有的经典理论不能适用，采用修正的〇gston筛分模型解释了 DNA毛细管WA凝胶电泳迁移 率依赖于电场强度与片段长度的关系，认为实验数据偏离〇gston模型是由于DNA分子在高电场下发 生了形变，得到反映这种形变的简单理论公式，使原来仅适用于低电场、小分子量以及球形粒子的 Ogston理论得到扩展，该公式提供了线性聚丙烯酰胺筛分机理的相关物理模型，改变筛分介质浓度，实 验现象也能用该模型很好地描述。此简单模型能很好地估测DNA分子的不同片段长度在不同电场强 度下的迁移率，用它可以作简单统一的曲线图以了解在LPA凝胶系统下的电泳特性。