部分水解聚丙稀酰胺（partially hydrolyzed polyacrylamide，HPAM)以其良好的絮凝性被广泛 用来提高原油的釆收率[1],聚丙烯酰胺注入地下 后，少部分随原油被采出，而大部分存在于油层中，随原油吸附在土壤及岩石表面，导致油井周 围的土壤中含有大量的聚丙烯酰胺和原油，给环 境带来危害[2]。微生物降解以其特有的无害化处理 将成为解决聚丙烯酰胺引起环境污染潜在毒性的 有效手段[3]。然而，游离微生物在处理含聚污水的 过程中菌体易流失，且污水中的一些有害物质会 对微生物产生毒害作用[4]。而微生物固定化技术可 以减轻或消除菌体的流失，并且使微生物保持活 性，可反复使用，固定化后微生物对有毒物质的 承受能力及对有机物的降解能力都有明显的提 高[5]。因此微生物固定化技术成为生物及环境领域 的研宄热点[6]。目前，微生物固定化的制备方法可 分为吸附法、共价法、包埋法和交联法4种[7]。
作者采用微生物固定化方法处理聚丙烯酰胺污 染和石油污染的土壤，从污染土壤中筛选出聚丙 烯酰胺和原油高效降解菌，筛选出的菌株既可以 以聚丙烯酰胺作为唯一氮源又可作为唯一作为碳 源被利用，解决了之前研宄中聚丙烯酰胺只能作 为微生物繁殖的氮源不能作为碳源的缺陷。并且 选择包埋固定化方法处理聚丙烯酰胺污染土壤。
1实验材料
1.1土壤样品
实验用土壤采自大庆油田采油四厂的一口聚丙 烯酰胺与原油污染的井场，在离地表约5〜20cm处 取样，将取得的样品装入己经灭菌的样品袋中， 密封。过40目筛，样品放置于冰箱中4°C保存。
1.2培养基
(1)无机盐培养基(g/L): K2HPCV3H20 1.0, NH4NO3 1.0 , KH2PO4 1.0，CaCl2 0.02， MgS04,7H20 0.5，FeCl3 痕量。
(2)分离、纯化培养基(g/L):向上述（1)的 培养基中加入HPAM 0.5,琼脂1.5%〜2.0%，调节 pH值至7.2。
(3)活化培养基(g/L): HPAM0.5, NaC10.5， 蛋白胨 6.0,尿素 9.0，KH2P〇4〇.5, MgSO40.5。
(4)基础培养基(g/L):向上述（1)的培养基 中加入HPAM0.5,调节pH=7.0。
(5)菌种保藏斜面培养基：牛肉膏蛋白胨培养 基（细菌）和马丁氏培养基（真菌）。
2实验方法
2.1菌种筛选与鉴定
(1)菌种筛选将10 g聚丙烯酰胺污染的土 壤样品加入到含聚丙烯酰胺100 mg/L，葡萄糖500 mg/L的上述1.2节（1)的无机盐培养基中，HZQ- X100立式恒温振荡培养箱，120r/min，35 °C下培 养，待培养液变浑浊，吸取5 mL培养液，将移取 的液体加到含聚丙烯酰胺300 mg/L,葡萄糖 300 mg/L的培养基中放入恒温振荡培养箱继续培 养，重复上述过程直到细菌在含聚丙烯酰胺 500 mg/L,葡萄糖浓度为0 mg/L的培养基中能生 长为止。制作上述1.2节（2)的分离、纯化培养 基，接种环挑取微生物培养液在培养基上划线， 划线之后将培养基放入温度为35 °C，转速为120 r/min的振荡培养箱中培养，待长出菌落后，通过 电镜观察菌株是否纯化。
(2)菌种鉴定微生物菌株的形态观察与生理 生化反应参照常见细菌系统鉴定手册[8]与伯杰氏细 菌鉴定手册。将菌株初步鉴定到属。
2.2测定方法
(1)聚丙烯酰胺降解率的测定：采用淀粉-碘 化镉比色法测定聚丙烯酰胺的浓度。
(2)土壤原油含量的测定：分光光度法[9]。
23菌体生物量的测定
采用722型可见分光光度计测定溶液的0£>66〇 值（光密度）来表示生物生长量的多少，〇£>值是 物质在溶液中吸收特定波长光线强弱的参数。在 波长为660 nm处对含聚丙烯酰胺的微生物培养液 进行光密度的测量，光密度值与菌群菌数成正 比。将单菌以3%的体积比接入1.2节（4)的基础 培养基中，在35 °C、120 r/min条件下放入振荡培 养箱中培养，以蒸馏水作为空白对照进行测定， 以此作为微生物菌群生长曲线的参考指标。
2.4单一菌种与混合菌降解聚丙烯酿胺和原油的 效果比较
将活化后的单一菌种与4种单菌Rl，R2, R3, Y3的混合菌按照3%的总体积分数分别加入上 述1.2节（4)的基础培养基中，于35 °C、120 r/min 条件下放入振荡培养箱中培养。3天后测HPAM与 原油的去除率，比较单一菌种与混合菌种对 HPAM和原油的降解效果。
2.5微生物固定化颗粒的制备
(1)制备湿菌体将筛选出四种单菌的混合菌 作为固定化的菌体，将菌株依次接入200 mL的1.2 节（3)所示的活化培养基中，经过4次连续活化。 取活化后的培养液2 mL加入到200 mL的富集培养 基中培养2〜3天，富集培养基经离心机离心，得
到湿菌体。
(2)包埋法固定化颗粒的制备4种固定化方 法中包埋固定化法以其操作简单，对微生物活性 影响小，制作的固定化微生物小球的强度高等优 点优于其它3种固定化方法，所以本实验采用包埋 法。以蒸馏水配置一定浓度的包埋载体溶液，加 入一定量的湿菌体，用5 mL注射器吸取载体溶 液，将载体溶液滴入一定浓度的交联剂中，交联 一定时间，将固定化颗粒放入200 mL的1.2节(4) 所不的基础培养基中，35 °C，120r/min振荡培养 箱中培养降解聚丙烯酰胺。
(3)5种包埋固定化制备方法采用5种包埋 法进行微生物的固定化，5种包埋固定化法制备微 生物固定化颗粒的条件如表1所示。
按照表1中的制备条件制备固定化颗粒，比较 5种包埋法制备微生物固定化颗粒的难易程度、小 球强度和初性以及制备费用，从中选择一种制备 费用低廉、制备容易、强度和初性都较好的包埋 方法。
2.6微生物固定化颗粒降解HPAM和原油的效果
以固定化颗粒对聚丙烯酰胺的降解率与对原油 的去除率来比较几种包埋固定化方法。按照表1中 的5种包埋固定化制备方法，制作固定化颗粒，各 称取10 mL载体与湿菌体的混合物制得的固定化颗 粒，分别放入200 mL的1.2节（4)所示的基础培 养基中，在35 °C, 120 r/min振荡培养箱中培养3 天，测聚丙烯酰胺的降解率。
2.7微生物固定化处理采油污水污染土壤
取大庆油田采油四厂的一口井场取回的聚丙烯 酰胺与原油污染土壤，先除去其中的砖块、瓦砾 等杂物后自然风干，再将土样过40目筛，得到颗 粒大小均匀的土样，将土壤样品加入到1.2节（1) 所示的200 mL基础培养基中，测得培养基中聚丙 烯酰胺浓度为500 mg/L,原油浓度为733.21 mg/L。取10 mL PVA+海藻酸钠+添加剂法制得的 载体与湿菌体的混合物制得的固定化颗粒放入上 述培养基中，在35 °C，120 r/min振荡培养箱中培 养，每3天测聚丙烯酰胺的降解率，并采用分光光 度法测原油含量。
3结果与讨论
3.1菌种筛选结果
经分离纯化得到4株对聚丙烯酰胺有降解效果 的菌种，即Rl、R2、R3、Y3。菌落图片和菌株电 镜扫描图片如图1所示。参照《伯杰氏细菌鉴定手 册》及《常见细菌系统鉴定手册》，可以初步鉴定： R1为芽孢乳杆菌属，R2为微球菌属，R3、Y3为 假单胞菌属菌株。
3.2标准曲线绘制
以HPAM标准溶液浓度为横坐标，可见分光 光度计测得的〇/)42〇值为纵坐标绘制的HPAM浓 度-吸光度标准曲线。曲线的线性回归方程为 y=0.0386jc+0.0019，/?2=0.9995。测定待测溶液吸光 度值，即可从线性回归方程计算出待测溶液的实 际HPAM浓度。
33单菌生物量的测定
以〇乃66()值代表细菌的生物量，菌体生长量越 多，培养基越浑浊，〇/?66()值越大。因此，OD66f) 值越大。表示菌体生物量越多。微生物生长曲线 如图2所示。
如图2所示，微生物的生长曲线反映一种微生 物在一定生活环境中的生长繁殖和死亡规律。由 图2的生长曲线可以看出，4种菌体在含500 mg/L 聚丙烯酰胺的培养基中生长繁殖，菌体经历了停
表1 5种包埋法制备微生物固定化颗粒的条件
包埋方法包埋剂/g蒸馏水
/mL湿菌购载 体质量比交联剂交联时间
海藻酸钠+活性炭粉海藻酸钠2,活性炭0.5481:24% 的 CaCl224 h
海藻酸钠包埋与戊二醛交联结合海藻酸钠2,活性炭0.5481:24%的CaCl21.0%的戊二醛戊二醛交联1〜2天
PVA+海藻酸钻+添加剂PVA10,海藻酸钠1901:22%的CaCl2饱和硼酸溶液CaCl2与饱和硼酸共同交联24 h
Si〇2 3, CaC〇3〇.3
PVA冷冻PVA4,海藻酸钠1451:24% 的 CaCl2于冰箱冷冻室在-i5 °c下冷冻过夜，
再在室温下解冻，重复冷冻解冻4次
明胶一戊二醛明胶201001:21.0%的戊二醛戊二醛交联2天
高于4种单菌，混合菌对HPAM的降解率在第3 天基本保持稳定，达到55%以上，对原油的去除率 可达到75%以上。这可能是由于单一菌种不具备一 整套完整的酶系统或基因成分降解这些不易降解 的有机物，而微生物群落中不同基因的拥有者却 可能发生基因交换或重组，从而导致新的降解途 径的实现。
3.5微生物固定化
(1)5种包埋方法比较对5种包埋法的制备 难易程度、固定化后小球的强度和軔性及制作成 本进行对比，结果如表2所示，海藻酸钠包埋与戊 二醛交联结合法与明胶-戊二醛法这两种方法制作 费用高，且明胶-戊二醛法操作较困难，制成的固 定化颗粒形状不规则，海藻酸钠包埋与戊二醛交 联结合法制备的小球初性、强度一般。因此排除 海藻酸钠包埋与戊二醛交联结合法与明胶一戊二 醛法这两种方法，选用其余3种制备费用低廉的方 法测定固定化微生物颗粒降解HPAM和原油的 效果。
图4混合菌与单菌对原油去除率的比较
滞期、对数期、稳定期和衰亡期。
3.4混合菌的优势
由图3、图4可知，Rl、R2、R3、Y3四种单 菌组成的混合菌对HPAM和原油的去除率都明显
5种包埋法制备固定化颗粒的难易程度、小球
• 950 •化 工进展2013年第32卷
表2 5种包埋固定化方法的比较
包埋方法制备难易小球强度和初性费用
海藻酸钠+活性炭粉操作较简单，成球容易，小球体积较小小球有一定的韧性，但强度不好，易破碎较低
海藻酸钠包埋与戊二醛交联结合操作较简单，成球容易，小球体积较小小球韧性、强度较一般较高
PVA+海藻酸钠+添加剂操作较简单，成球容易，小球体积较大固定化小球韧性一般，但强度好，球体硬低
PVA冷冻操作相对简便，较易成球，小球体积较小强度一般，韧性很好低
明胶一戊二醛操作较困难，明胶黏性较大，不易成球，小球的形固定化小球强度很好，有初性较高
状不规则
表3固定化颗粒降解HPAM和原油的效果
包埋方法聚丙烯酰胺的降解率/%原油去除率
海藻酸钠+活性炭粉60.381.4
PVA+海藻酸钠+添加剂78.298.3
PVA冷冻61.481.2
强度和初性以及制备费用比较如表2所示。
(2)微生物固定化颗粒降解HPAM和原油的 效果通过由表2筛选出的3种包埋固定化方法制 得的固定化颗粒对聚丙烯酰胺的降解率的测定， 结果如表3所示，海藻酸钠+活性炭粉法与PVA冷 冻法对聚丙烯酰胺降解率与对原油的去除率低于 PVA+海藻酸钠+添加剂法。因此，排除海藻酸钠+ 活性炭粉法与PVA冷冻法两种方法。
综合表2与表3,得知PVA+海藻酸钠+添加 剂法制得的固定化颗粒的活性较好，操作简 单，强度好，不易破损，且费用低，PVA+海藻 酸钠+添加剂法对聚丙烯酰胺的降解率高于其它 两种包埋方法。因此选用PVA+海藻酸钠+添加 剂法对含聚丙烯酰胺的土壤进行处理。张秀霞 等[1()]以天然有机材料YJ-05为载体，采用吸附 法制备固定化MM-7对土壤中石油的降解率可 达到27.1%。
由之前的实验3.4节混合菌的优势可知，游离 的混合菌对HPAM降解率达到55%以上，对原油 的去除率可达到75%以上，而由表3得知在相同实 验条件下PVA+海藻酸钠+添加剂法制得的固定化 颗粒对聚丙烯酰胺的降解率可达到78.2%，对原油 的去处率可达到98.3%。可见固定化后的菌株对聚 丙烯酰胺与原油的处理能力要远远强于没有固定 化的游离菌株。
PVA+海藻酸钠+添加剂法制得的固定化颗粒 如图5所示。图5(a)为10%PVA-1%海藻酸钠与湿 菌体按1 : 2体积比混合后，加入3%Si02,
0.3%CaCO3。用5 mL注射器注射到2%的CaCl2饱 和硼酸溶液中成球，CaCl2与饱和硼酸共同交联24 h后的固定化颗粒，颗粒并无拖尾现象。图5(b)为 在相同制备方法时加入3%的活性炭制得的固定化 颗粒，以增加固定化颗粒的通透性，提高微生物 的活性。
3.6微生物固定化处理采油污水污染土壤
PVA+海藻酸钠+添加剂法制得的微生物固定 化颗粒处理采油污水污染的土壤，处理后的土壤 样品放入电热鼓风干燥箱中干燥后送回井场，固 定化颗粒降解土壤中HPAM和原油的效果实验结 果如表4所示。由表4可以看出，PVA+海藻酸钠+ 添加剂法制备的固定化颗粒对采油污水污染土壤 进行处理，固定化颗粒对HPAM、原油的去除率 分别为79.5%和98.7%。
表4固定化颗粒降解土壤中HPAM和原油的效果
时间
/dHPAM含量 /mg-L_IHPAM降解率
/%原油含量 /mg.L_1原油降解率
/%
0500.050733.210
3102.5179.519.598.7
622.2178.31.5184.1
97.6265.70.3676.2
123.2157.80.0975
151.4156.10.0455.6
180.62560.0250
210.27560.0150
4结论
(1)实验以筛选出以聚丙烯酰胺作为唯一碳 源和唯一氮源的菌株为目的，从含HPAM的土壤 中分离、纯化得到对HPAM具有高效降解能力的 Rl、R2、R3、Y3四种单菌。对筛选出的单菌进行 鉴定可知：R1为芽孢乳杆菌属，R2为微球菌属， R3、Y3为假单胞菌属菌株。
(2)将 Rl、R2、R3、Y3 混合，在 35°C, 120 r/min条件下，混合菌对HPAM的降解率可达到 55%以上，对原油的去除率达到75%以上。明显高 于4种单一菌种对HPAM和原油的去除率。
(3)为提高混合菌对聚丙烯酰胺与原油的去除 率，采用固定化法对混合菌进行固定化实验。比 较5种包埋固定化法得知，PVA+海藻酸钠+添加剂 法对聚丙烯酰胺与原油的去除率高于其它4种包埋 固定化方法。PVA+海藻酸钠+添加剂法制得的固 定化颗粒的活性较好，操作简单，强度好，不易 破损，且费用低。
(4)游离的混合菌对HPAM与原油的去除率 可达到75%与55%以上，而PVA+海藻酸钠+添加 剂法制得的固定化颗粒对聚丙烯酰胺与原油的去 处率可达到78.2%与98.3%。可见固定化后的菌株 对聚丙烯酰胺与原油的处理能力要远远强于没有 固定化的游离菌株。
(5)PVA+海藻酸钠+添加剂法制备的固定化 颗粒对采油污水污染土壤进行处理，聚丙烯酰胺 的去除率可达到79.5%，原油的去除率可达到 98.7%。