超氧化物歧化酶(EC1. 15. 1. 1，简称SOD)是广泛存在于生物体内的一类金属酶，根据金属辅基的不 同可分为Mn-S0D、Fe-S0D和CuZn-SOD 3种类型，近年来还从链霉菌属中发现了 Ni-S0Dtu，从日本沼虾 中纯化66. 1 ku的EC-S0D，发现了仓鼠和人胞质中的240 ~260 ku及135和270 ku的EC-SOD125，它们都 具有催化超氧阴离子自由基形成过氧化氢和水的反应能力，在防御活性氧对生物体的伤害、在植物的逆境 生理、在预防和治疗由自由基诱发的一系列疾病,如肿瘤、辐射损伤、心脑血管疾病等方面都起到了很電要 的作用.对3种类型SOD同工酶的分离和鉴定是生物学和医学中会遇到的实际问题，通常都是采用聚丙 烯酰胺凝胶电泳（PAGE)的定位染色法f3],我们在实际应用中发现样品点样量少时,SOD弱带难以显示， 点样量大时植物次生物质对酶带显示有干扰，且谱带清晰度和重复性都不理想，时有谱带重叠现象出现， 谱带分离的/?/值与酶类型间无特定规律可寻，在改用聚丙烯酰胺凝胶梯度电泳（GPGE)后得到了较满意 的效果.本文将通过GPGE和PAGE的比较，旨在建立用GPGE分离和鉴定SOD同工酶的新方法.
1材料和方法
1.1材料、主要试剂及仪器
新鲜的植物材料采A南京地区和本院温室，当天采集后，用蒸馏水洗净后备用.
枸杞Fe-SOD、牛血SOD及花生CuZn-SOD分别按其文献14〜纯化至电泳纯•丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰 胺、SDS、甲硫氨酸（Sigma) ,NBT(南京卓尔生化有限公司），其它试剂为闰产分析纯或生化试剂.主要仪器 为岛津CS -9000双波长薄层扫描仪，CSR -4高压电泳仪，梯度凝胶电泳灌胶装置.
1.2方法
1.2. 1 SOD粗酶液的制备
将实验材料剪碎，按每克鲜重加人3 mL的50 mm〇I/L磷酸缓冲液（PH7. 8)进行研磨匀浆，勻浆液 10 000 r/min离心15 min后，上清液即为枏酶液，用于实验或分装于小离心符内，-25T保存备用.
1.2.2SOD同工酶的电泳分离和染色定位
PAGE按罗广华等[3]方法，在7. 5%或10%的分离胶上进行;GPGE按程光宇等m及张龙翔[8]方法，在 4% ~35%梯度胶上进行，加样前以100 V稳压预电泳30 min,加样后在4T电泳，先以150 V稳压电泳1 h 后，将电压逐步提高到300 V稳压电泳15 h(电泳持续4 500 V • h以上）；二次电泳按程光宁等w方法进 行，第一向为10%的PAGE，在电泳结束后切取具有SOD活性E未经染色的K带，放在已预电泳过的4% ~35%梯度胶上端，加人PAGE中3. 5%的浓缩胶液，采用光照聚合将其固定后进行第二向GPGE,同时以 相同酶液量在梯度胶上点样.电泳结束后进行酶活性染色，采用拍照或扫描方法记录SOD同工酶图谱.
1.2.3SOD同工酶类型的鉴定
(1)参照Bridges和Salin的方法[1°]，以KCN和H202两种抑制剂鉴定SOD类型.
(2)利用梯度胶具有分子筛效应w及其/?/值与3种SOD相对分子质量存在差异[111的特点，由/?/值 初步判断SOD类型.
(3〉利用CuZn-SOD对SDS不敏感、Mn-SOD和Fe-SOD对SDS敏感的特性[ll’m9]，向粗酶液中加入 SDS溶液使其终浓度达1 %后，于371保温1 h,分别进行SOD同1：酶的GPGE和PAGE并进行酶活性染 色.CuZn-SOD对SDS不敏感，谱带留存,Mn-SOD和Fe-SOD对SDS敏感，谱带消失.
2结果与分析
2.1GPGE和PAGE对分离SOD同工酶的影响
结果见图1.14种植物的3种类型SOD在4% -35%的梯度胶中都得到较好的分离，谱带清晰，未见 有干扰现象，根据/?/值可分为A、B、C 3个区域:A区的/?/值最小（<3. 6),谱带都为1条;C区的/?/值最 大（>5.0)，其中谱带数目因植物种类不同而异，如羊蹄、拔契仅有1 ~2条，而鸭趾草、马兜铃等则多于4 条;B区取值位于A、B区之间，如省谱带一般都为1条，但许多植物缺乏这种类型谱带.同时，从其/?/值 大小，还可初步判定各同工酶的相对分子质量和类型，取值最小的A区同T酶相对分子质量最大，应为 Mn-S0D;ft/最大的C区同工酶相对分子质量最小，应是CuZn-SOD;而介于两者之间B区的同T酶可认为 是Fe-SOD，如南苜蓿、金荞麦的Fe-SOD。
同一样品在相同加样量下进行10% PAGE,SOD谱带分离效果远不如GPGE,谱带分布及/?/值与 SOD类型之间无特定规律可寻，其中紫花地丁中的次生物质对SOD显示干扰并影响到周围的谱带（图1 的11).可见，在PAGE中SOD的/?/值因受电荷、胶浓度、pH值等多种因素影响，不能作为SOD类型鉴定 的依据，在GPGE中的切值棑除了电荷等因素的影响，与分子大小有相关性,故它可用于测定天然酶和蛋 白质的相对分子质量的灵敏度和分辨率比较
以牛血SOD为标准，比较GPGE和PAGE检测SOD的灵敏度和分辨率（见图2).当以相同加样量分 别进行GPGE和PAGE时，在PAGE图谱上S0D的检测浓度为1. 56 x l〇_l3mol，在GPGE图谱上，SOD浓 度为1. 56 x l〇-14m〇l时谱带清晰，当再稀释10倍后仍能见到SOD谱带（图片未列出），说明PAGE和 GPGE检测SOD的灵敏度分别为1. 56 x 10 —l3mol和1. 56 x 1(T15mol.在GPGE图谱中牛血SOD活性染色 与蛋白染色带边缘清晰，呈扁平状，在1. 56 x 10_12mol SOD时活性染色带可分辨出1条主带和2条次带 及1条弱带（图2中A3)，与6. 24 x l(T9m〇l SOD时的蛋白带相互对应（图2中B5);而在同样加样量下的 PAGE图谱中谱带边缘模糊，只能分辨出1条主带和1条次带（图2中C10).说明GPGE比PAGE有更高 的分辨率.
花生SOD粗酶液（125 U/mL)分别以1 pL进行GPGE和PAGE时，在GPGE图谱上Mn-SOD和CuZn- SOD谱带非常清晰（图2的13)，但在PAGE图谱上已无明显的谱带（图2的19) •花生CuZn-SOD在GPGE 中分别加样〇. 016 jig和0. 128 (ig，在PAGE中分別加样0. 032 jtg和0. 32 jig时，低、高浓度SOD谱带扫描后峰面积之比分别为1:3. 37和1:1. 54.从图1和图4还能看出南苜蓿、番茄、金荞麦等在梯度胶上显示出 4 ~5条带，但PAGE图谱上显示2 ~3条.纯化的枸杞Fe-SOD有3条带，但在GPGE上的灵敏度和分辨率 明显高于PAGE(图3的4,9).可见,对于植物的粗酶液和纯酶，GPGE同样比PAGE有较高的灵敏度和分 辨率.
2.3不同胶浓度对3种SOD类型分离和鉴定的影响
枸杞和香橼都含有3种类型S0D，它们在不同胶浓度下的分离结果见图3.枸杞在7. 5% PAGE中有3 条Fe-SOD，它们的/?/最大,CuZn-SOD也有3条，它们的/?/居中，Mn-SOD不成条带，很难确定•在10% 的PAGE中3条Fe-SOD带上移已与第三条CuZn-SOD相重叠，Mn-SOD带已能基本分清.同时可见在
7.5%和10%的PAGE中还存在CuZn-SOD抑制不完全的现象，经KCN和H202处理后在负极处的一些谱 带性质也很难判断;在4% ~ 35%的梯度胶中3种类型SOD谱带完全分离，Fe-SOD带上移至Mn-SOD和 CuZn-SOD间，与纯化的Fe-SOD有相同的值.香橼SOD在10%的PAGE中，有1条对KCN和H202都 敏感的CuZn-SOD谱带，它的/?/值最小，Mn-SOD和Fe-SOD即使以抑制剂处理，也因未分离开和分辨率差 无法判断.在4% ~35%的梯度胶中3种SOD同工酶都有规律地完全分开，/?/值最小的1条为Mn-SOD，甩 值较大的2条为CuZn-S0D，i?/值位于两者之间的为Fe-SOD.
可见，枸杞和香橼的3种SOD类型，它们在7.5%和10%的PAGE中分离难有规律可循，如香橼 CuZn-SOD的/?/值在同工酶中最小（图3D)，同为Fe-SOD,在枸杞中的/?/值最大（图3A)，在朱拮中/?/值 却最小（图5A).当用KCN和H202鉴定SOD类型时，常有抑制不完全的现象，有的因谱带重叠，即使采用 抑制剂也很难有结果，如香橡的Fe-SOD、Mn-S0D(图3D)和朱桔的Mn-SOD、CuZn-S0D(图5A).但在4% -35%梯度胶上，如存在Fe-SOD时，其取值总是位于Mn-SOD和CuZn-SOD之间，枸杞、香橼和朱桔3种 类型SOD在梯度胶上均有此规律可寻.在梯度胶中以其取值大小判断SOD的类型的结果与用抑制剂处 理的结果完全一致.
样品经1% SDS处理后，以相同量分別进行GPGE和PAGE,结果见图4.在梯度胶中，7种植物在A 区的SOD谱带活性都被SDS抑制，无一例外，表明它们都是Mn-SOD;C区的SOD谱带对SDS不敏感，为 CuZn-SOD,其中金荞麦和还亮草都含有1条对SDS敏感的谱带，但它们经KCN和H202处理谱带消失，具 有CuZn-SOD的典型特征，这些谱带的/?/值在经SDS处理前后一致• B区带中被SDS抑制的为Fe-SOD, 其中代代花和南苜蓿的Fe-SOD的含量大于30%，金荞麦、马兜铃、无花果、三叶草都含有对SDS敏感的 Fe-SOD(结果待发表）•经SDS处理后留存的为CuZn-SOD，而Mn-SOD和Fe-SOD谱带消失，Mn-SOD和 Fe-SOD的区分则可根据它们在GPGE图谱上的/?/值确定.由此可见，GPGE结合SDS处理是SOD类型鉴 定的有效途径之一.
结果见图5.朱桔在二次电泳（图5C)中的a、b带 对应于GPGE图谱上的a、b带（图5B)和PAGE图谱上 的a、b带（图5A)，分别为Mn-SOD和Fe-SOD,但在 PAGE图谱上a带/?/值大于b带;c带有2条为CuZn- S0D，在二次电泳和梯度胶中是相互对应，但在PAGE 图谱上a、c带混杂，从纯化的Mn-SOD和CuZn-SOD的 PAGE图谱上可看出a、c是重叠带^.在二次电泳中 新、老叶中Fe-SOD活性都约占SOD总活性的30%，与 GPGE中的结果相当，但在PAGE中老叶这一比例约 30%，新叶低于5%.
从二次电泳中SOD谱带在PAGE和GPGE中的对 应关系可看出，朱桔3种SOD类型在GPGE中能按照 分子大小有效地分离和鉴别，但在PAGE中SOD谱带 有重叠现象，分离不彻底，新叶中的植物次生物质干扰 了 SOD活性显示，甚至无谱带.
3讨论
目前国内外在SOD同工酶的分离和鉴定研究中都是采用10%左右的PAGE，但分离效果和图谱都不 很理想.我们在枸杞果实SOD研究中采用了 GPGE,并首次报道了枸杞含有Fe-S0DK]，在随后的研究中陆 续发现了何首乌、香橼等十几种高等植物存在Fe-S0D[14].迄今为止国内外报道含Fe-SOD的高等植物仅 番茄、银杏、睡莲、芸苔、樟树等十几种U°’~9],SOD同工酶的分离也都是采用PAGE,我们的发现与用 GPGE替代PAGE研究SOD电泳技术改进密切相关，但对GPGE分离和鉴定SOD类型和SOD谱带在 GPGE与PAGE中相互对应关系的研究H内外尚未见报道，本文对此进行了初步探讨.
3.1 GPGE比PAGE能更有效地分离和鉴定SOD同工酶类型
本研究表明，在GPGE图谱上的SOD谱带可明显分为A、B、C 3个区，A区/?/值最小，对SDS敏感，为 分子量最大的Mn-SOD;C区/?/值最大，对SDS不敏感，为相对分子质量较小的CuZn-SOD;B区的谱带甩 值位于二者之间，经SDS处理后消失，为Fe-SOD•由于GPGE是根据孔径大小分离酶和蛋白质，其ft/值与SOD分子大小有相关性[8]，使酶的分离和鉴定变得相对容易和简单化，当结合SDS处理时能将CuZn-SOD 和Mn-SOD、Fe-SOD区分开，由于Fe-SOD的/?/值通常位于Mn-SOD和CuZn-SOD间，故可确定SOD类型. 本文中枸杞、朱拮、香橼存在的3种SOD类型符合这一规律，当采用KCN和H202对枸杞、香橼、金荞麦和 还亮草等SOD类型进行鉴定时，结果与GPGE中各谱带取值与SDS处理相结合来确定酶类型的结果一 致，说明了将GPGE中各谱带/?/值与SDS处理的结果相结合是分离和鉴定SOD类型的一种简便有效的 新方法.在传统的PAGE中SOD谱带受其所带电荷、分子大小、胶浓度等多种因素影响,分离的取值变化 较大，如本文中Fe-SOD的/?/值在枸杞中最大，在朱桔中最小，/?/值与SOD类型及分子大小间无特定规律 可寻，鉴定SOD类型要采用KCN和H202等抑制剂，由于KCN为剧毒品，使SOD类型的研究受到了限制， 当酶带相互重叠时甚至无法有结果（如香橼、朱桔等）.可见，在SOD分离和类型鉴定方面GPGE比PAGE 有更大的优势和应用前景.
3.2GPGE分离SOD的灵敏度和分辨率
本文对GPGE和PAGE检测SOD的灵敏度和分辨率进行了比较，结果表明，PAGE检测牛血SOD灵 敏度为10_l3m〇l，GPGE检测牛血SOD灵敏度可达10_15 mol.由于GPGE的灵敏度比PAGE高2个数量 级，可检测到在PAGE图谱上因含量很低难以显示或活性低于5%的Fe-SOD谱带（如马兜铃、无花果三 叶草等），它们的矽值都位于Mn-SOD和CuZn-SOD的B区之间.在GPGE图谱中SOD谱带清晰,点样量 适中时为扁平形，边缘明显，有较高的分辨率，牛血SOD可清晰辨认出4条带，番茄和朱桔粗酶液可分辨 出4 ~5条带，在PAGE图谱中因干扰的存在大大影响了谱带的分辨，它们的谱带较模糊只有2 ~3条.纯 化的枸杞Fe-SOD在GPGE和PAGE中都有3条带，但前者的灵敏度和分辨率明显高于后者.高的灵敏度 和分辨率使实验结果更准确可靠，可见，GPGE分离SOD特別是Fe-SOD是比PAGE更好的方法.
3.3GPGE分离和鉴定SOD的可靠性
本文发现在C区对SDS敏感的谱带（金养麦和还亮草）也能被KCN和H202抑制为CuZn-SOD,说明 了以/?/值来判断SOD类型是可靠的.植物材料中的次生物质丰富，它们会与SOD结合影响酶显示[20]，朱 桔Fe-SOD(新叶）和何首乌Mn-SOD(图片未列出）在PAGE中几乎无带，在GPGE中含量都达30%左右， 与二次电泳结果一致，提示在GPGE中经长时间电泳后干扰物可能与SOD分离泳出凝胶，能真实反映出 全部SOD谱带，而PAGE会造成一些SOD的漏检.SOD谱带在GPGE和PAGE中对应关系由二次电泳反 映出来，GPGE中的SOD谱带通过二次电泳都能和PAGE的相互对应,说明了 GPGE分离和鉴定SOD的 结果是可靠的，但PAGE中3种SOD类型的/?/值变化很大,与酶类型间无相关性，同时，通过二次电泳还 可以看出，GPGE对在PAGE上重叠和有干扰的SOD谱带的分离和鉴定是有效的.